【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测，具体涉及一种基于lamp环介导等温扩增技术可视化快速鉴别致病性沙门氏菌的试剂盒及其专用引物。
技术介绍
1、沙门氏菌属(salmonella spp)是肠杆菌科中最重要的肠道致病菌属，该属的大部分成员具有非常强的致病性。本属菌型繁多，分布广泛，目前已经发现2523种血清型，其中许多血清型菌可以感染动物(例如牛)引起病症。例如沙门氏菌感染的病牛的急性型症状主要出现胃肠炎症状，发病初期体温逐渐升高，症状严重时甚至能够达到42.5℃，且持续高烧不退，呼吸加快，食欲减退，出现下痢、腹痛，排出液状粪便，并混杂纤维素絮片，呈褐色或者灰黄色，有时还会混杂血丝，并散发恶臭气味。发病中后期，病牛会出现肺炎症状，成年妊娠母牛患病后会发生流产。沙门氏菌感染的病牛的慢性型症状特征为病牛主要出现胸膜肺炎或者肺炎症状，体温明显升高，可达到40-41℃，呼吸困难，明显加快，经常出现湿咳，脉搏加速，有黏液脓性鼻液流出，当病牛出现严重的肺炎症状时，体温会进一步升高，接着食欲废绝，发出痛苦的呻吟，并只能够卧地不起，往往出现咳嗽，有些甚至出现腕关节炎或者跗关节炎。因此，沙门氏菌感染可造成养殖业的巨大损失，因此有需要对致病性沙门氏菌进行检测，以防控该疾病的大范围传播。
2、目前最常用的检测沙门氏菌的方法为荧光定量pcr，该方法的检测灵敏度和特异性均较好，但操作复杂，仪器昂贵，难以在基层实际生产中普及应用。专利文献cn102424842a(以下称文献1)公开一种沙门氏菌的lamp检测方法，其根据沙门氏菌的特异性保守靶序列inva基因设
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的一个或多个问题，本专利技术一个方面提供一种检测沙门氏菌的lamp专用引物，其包括外引物对、内引物对和环引物对，其中：
2、所述外引物对包括f3和b3，其中所述f3的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述b3的核苷酸序列如seq id no:2所示；
3、所述内引物对包括fip和bip，其中所述fip的核苷酸序列如seq id no:3所示，所述bip的核苷酸序列如seq id no:4；
4、所述环引物对包括lf和lb，其中所述lf核苷酸序列如seq id no:5所示，所述lb的核苷酸序列如seq id no:6所示。
5、本专利技术另一方面提供一种检测沙门氏菌的lamp试剂盒，其包括上述的lamp专用引物。
6、在一些实施方式中，所述lamp试剂盒还包括2.5×ph sensitive reactionbuffer和bst ii dna polymerase。
7、在一些实施方式中，所述lamp试剂盒还包括核酸染料和/或指示剂染料，其中所述核酸染料包括gelstain blue与equalbit dsdna hs reagent中之一或两者，所述指示剂染料包括og橙与中性红中之一或两者。
8、在一些实施方式中，所述lamp试剂盒还包括阴性对照，其中所述阴性对照为不含有沙门氏菌核酸的体系。
9、本专利技术再一方面还提供一种非疾病诊断目的的检测沙门氏菌的lamp方法，其包括以下步骤：
10、1)提取待测样品的核酸；
11、2)利用上述lamp专用引物或上述的lamp试剂盒与步骤1)提取的核酸或阴性对照配制lamp反应体系，进行环介导等温扩增；和
12、3)根据步骤2)的环介导等温扩增结果进行判定；
13、若所述待测样品的lamp扩增产物相较阴性对照在凝胶电泳结果中有清晰的目的条带、和/或在紫外/蓝光下有明显的荧光、和/或经肉眼观察有明显的变色反应，则判定待测样品为沙门氏菌阳性；否则判定为沙门氏菌阴性。
14、在一些实施方式中，步骤1)中所述提取待测样品的核酸的操作包括：将所述待测样品置于pbs中，将所得混合液置于90-100℃水浴锅或金属浴中保持5-15min进行热裂解，获得所述待测样品的核酸。
15、在一些实施方式中，步骤2)中所述lamp反应体系包括以下终浓度的组分：1×phsensitive reaction buffer，0.4-1μmol/l f3，0.4-1μmol/l b3，1.6-2.0μmol/l fip，1.6-2.0μmol/l bip，0.8-1.0μmol/l lf，0.8-1.0μmol/l lb和600-700units/ml bst iidna polymerase。
16、在一些实施方式中，步骤2)中所述环介导等温扩增的反应条件包括：反应温度为63-65℃，反应时间为15-45min。
17、在一些实施方式中，所述待测样品包括动物饲料、牛羊制品、动物疫苗生产原料、动物疫苗半成品。
18、基于以上技术方案提供的快速检测致病性沙门氏菌的lamp专用引物基于沙门氏菌的inva基因保守区域设计得到，包括seq id no:1所示的f3、seq id no:2所示的b3、seqid no:3所示的fip、seq id no:4所示的bip、seq id no:5所示的lf和seq id no:6所示的lb。经实施例结果表明，基于本专利技术提供的检测沙门氏菌的lamp引物的检测方法和检测试剂盒能够高灵敏度(检测最低限可达0.98pg/μl或以下，相对于上述文献1(6.97pg/μl)具有明显更低的检测下限)、高特异性检测沙门氏菌，并且具有检测周期短(可在15-45min内完成检测，检测效率高)、恒温检测、对设备要求低(不需要复杂仪器)、对鉴定检测人员水平要求低、且可视化检测结果等特点。因此本专利技术提供的lamp专用引物和试剂盒可适用于早期沙门氏菌疫情的现场快速检测，以及时控制疫情。
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1.一种检测沙门氏菌的LAMP专用引物，其包括外引物对、内引物对和环引物对，其中：
2.一种检测沙门氏菌的LAMP试剂盒，其包括权利要求1所述的LAMP专用引物。
3.根据权利要求2所述的LAMP试剂盒，其还包括2.5×pH Sensitive Reaction Buffer和Bst IIDNA Polymerase。
4.根据权利要求2或3所述的LAMP试剂盒，其还包括核酸染料和/或指示剂染料，其中所述核酸染料包括GelStain Blue与Equalbit dsDNA HS Reagent中之一或两者，所述指示剂染料包括OG橙与中性红中之一或两者。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的LAMP试剂盒，其还包括阴性对照，其中所述阴性对照为不含有沙门氏菌核酸的体系。
6.一种非疾病诊断目的的检测沙门氏菌的LAMP方法，其包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的LAMP方法，步骤1)中所述提取待测样品的核酸的操作包括：将所述待测样品置于PBS中，将所得混合液置于90-100℃水浴锅或金属浴中保持5-15min进
8.根据权利要求6或7所述的LAMP方法，步骤2)中所述LAMP反应体系包括以下终浓度的组分：1×pH Sensitive Reaction Buffer，0.4-1μmol/L F3，0.4-1μmol/L B3，1.6-2.0μmol/L FIP，1.6-2.0μmol/L BIP，0.8-1.0μmol/L LF，0.8-1.0μmol/L LB和600-700units/mL Bst IIDNA Polymerase。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的LAMP方法，步骤2)中所述环介导等温扩增的反应条件包括：反应温度为63-65℃，反应时间为15-45min。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的LAMP方法，其中所述待测样品包括动物饲料、牛羊制品、动物疫苗生产原料、动物疫苗半成品。
...【技术特征摘要】
1.一种检测沙门氏菌的lamp专用引物，其包括外引物对、内引物对和环引物对，其中：
2.一种检测沙门氏菌的lamp试剂盒，其包括权利要求1所述的lamp专用引物。
3.根据权利要求2所述的lamp试剂盒，其还包括2.5×ph sensitive reaction buffer和bst iidna polymerase。
4.根据权利要求2或3所述的lamp试剂盒，其还包括核酸染料和/或指示剂染料，其中所述核酸染料包括gelstain blue与equalbit dsdna hs reagent中之一或两者，所述指示剂染料包括og橙与中性红中之一或两者。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的lamp试剂盒，其还包括阴性对照，其中所述阴性对照为不含有沙门氏菌核酸的体系。
6.一种非疾病诊断目的的检测沙门氏菌的lamp方法，其包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的lamp方法，步骤1)中所述提取待测样品的核...
【专利技术属性】
技术研发人员：王鹏，辛俊利，黄海碧，赵丽霞，刘玉梅，张贵刚，杜宇荣，刘建奇，刘东霞，张彦婷，范文霞，李雪峰，刘浩，乔煜婷，
申请(专利权)人：金宇保灵生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：
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