【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物传染病检测，具体涉及一种牛结节性皮肤病的间接elisa抗体检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
1、牛结节性皮肤病(lumpy skin disease，lsd)是由牛结节性皮肤病病毒(lumpyskin disease virus，lsdv)引起的一种病毒性传染病，又称为牛疙瘩皮肤病、牛结节性皮炎和牛结节疹。lsd是一种能引起牛的急性、亚急性接触性传染病，该病发病率在5％至45％之间，病死率最高可达10％。临床上主要症状为体温升高、消瘦、淋巴结肿大、皮肤(黏膜、器官)表面广泛性结节及皮肤水肿等。此外，lsdv还可致原发性和继发性肺炎，母牛流产以及公牛暂时或永久不育，对养牛业危害较大，被世界动物卫生组织(oie)列为必须通报的动物疫病。
2、目前该病病原的检测方法很多，包括病毒的分离及鉴定、pcr分子检测、病毒中和试验、免疫荧光、电镜分析等，然而这些方法具有操作复杂、费用高、需要生物安全实验室、不能大范围在基层推广等缺点，因此很难在现场进行该病的流行病学调查与监测。血清学抗体检测方法因其操作简单快捷，已经广泛应用于基层对疫病进行筛查，且目前主要采取疫苗免疫与扑杀相结合的策略来防控牛结节性皮肤病，因此血清学抗体检测也成为自然感染监测和疫苗免疫效果评价的关键技术所在，然而现阶段用于牛结节性皮肤病的血清学抗体检测试剂盒还没有。因此，开发一种简便快捷、能大范围推广、对所有感染该病的牛以及免疫牛都能进行检测的血清学方法显的尤为重要。
技术实现思路
1、针对现有技术
2、在一些实施方式中，所述lsdv-orf122蛋白的氨基酸序列如序列表中seq id no:2所示。
3、在一些实施方式中，所述lsdv-orf122蛋白的编码基因的核苷酸序列如序列表中seq id no:1所示。
4、在一些实施方式中，所述lsdv-orf122蛋白通过以下方式获得：向受体大肠杆菌细胞中导入seq id no:1所示的lsdv-orf122蛋白的编码基因，得到重组大肠杆菌细胞；对所述重组大肠杆菌细胞进行诱导表达后，收集诱导表达后的重组大肠杆菌细胞；破碎所述诱导表达后的重组大肠杆菌细胞，得到包涵体；对所述包涵体进行变性，得到变性后的样品；将所述变性后的样品进行复性，得到复性后的样品；将所述复性后的样品进行纯化，得到纯化后的lsdv-orf122蛋白。
5、在一些实施方式中，所述变性在变性缓冲液中进行，所述变性缓冲液为20mmtris，6m gua-hcl，20mm dtt，ph8.5。所述复性在复性缓冲液中进行，所述复性缓冲液为50mm tris，1m gua-hcl，0.75mm arg，3mm gsh，1mm gssg，ph8.5。所述纯化为将复性后的蛋白进行ni株亲和层析，收集所述复性蛋白的洗脱峰。所述亲和层析所用层析介质为ge ni株，所述亲和层析洗脱液为20mm tris，0.5m nacl，0.5m咪唑，ph8.0。
6、在一些实施方式中，所述的间接elisa抗体检测试剂盒还包括：样品稀释液、酶标二抗及显色底物。
7、在一些实施方式中，所述样品稀释液为1×pbs，所述酶标二抗为以hrp标记的山羊抗牛抗体。
8、在一些实施方式中，所述的间接elisa抗体检测试剂盒还包括酶标抗体稀释液、其中含有吐温的磷酸缓冲液、tmb显色液和终止液(2％的硫酸溶液)。
9、本专利技术另一方面提供一种牛结节性皮肤病的间接elisa抗体检测试剂盒的制备方法，其包括将包含有lsdv-orf122蛋白的包被液包被于酶标板上，并封闭，得到包被有lsdv-orf122蛋白的酶标板，由其制备所述间接elisa抗体检测试剂盒。
10、在一些实施方式中，所述包含有lsdv-orf122蛋白的包被液的浓度为2-10μg/ml，可选为4-6μg/ml，进一步可选为6μg/ml。
11、在一些实施方式中，所述包被的条件为：4±0.5℃包被过夜。
12、在一些实施方式中，所述封闭的操作为：向酶标板的包被有lsdv-orf122蛋白的孔中加入含有0.8-1.2％bsa的pbst封闭液，37±0.5℃作用110-130min。
13、本专利技术再一方面还提供一种牛结节性皮肤病的间接elisa抗体检测方法，其包括以下步骤：
14、1)向上述的间接elisa抗体检测试剂盒中的酶标板的孔中加入待检样品，并作用一段时间后清洗；
15、2)向步骤1)的孔中加入酶标二抗，并作用一段时间后清洗；
16、3)向步骤2)的孔中加入tmb显色液，并作用一段时间；和
17、4)向步骤3)的孔中加入终止液，并使用酶标仪测定od450值。
18、在一些实施方式中，步骤1)中所述待检样品为用pbs稀释1:200-1:400倍，可选为1:200-1:300倍的牛血清，作用条件为37℃作用60-90min，可选为60-70min。
19、在一些实施方式中，步骤2)中所述酶标二抗为用pbs稀释1:60000-1:80000倍的山羊抗牛igg/辣根过氧化物酶，作用条件为37℃作用60-90min，可选为60-70min。
20、在一些实施方式中，步骤3)中所述作用的条件为：37℃作用15min。
21、在一些实施方式中，步骤4)中所述终止液为2％的硫酸溶液。
22、本专利技术又一方面还提供一种牛结节性皮肤病的间接elisa抗体检测的酶标板，其包被有lsdv-orf122蛋白。
23、基于以上技术方案提供的牛结节性皮肤病的间接elisa抗体检测试剂盒首次使用lsdv-orf122蛋白作为包被抗原包被酶标板，能够高准确度和高特异性检测免疫lsdv疫苗或感染牛结节性皮肤病病毒后所产生的抗体，可以满足我国现阶段lsdv感染、爆发、防控的检测需求，并可以用于评价lsdv疫苗的免疫效果。
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1.一种牛结节性皮肤病的间接ELISA抗体检测试剂盒，其包括：包被有LSDV-ORF122蛋白的酶标板。
2.根据权利要求1所述的间接ELISA抗体检测试剂盒，其中所述LSDV-ORF122蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1或2所述的间接ELISA抗体检测试剂盒，其中所述LSDV-ORF122蛋白的编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的间接ELISA抗体检测试剂盒，其还包括：样品稀释液、酶标二抗及显色底物；可选地，所述样品稀释液为1×PBS，所述酶标二抗为以HRP标记的山羊抗牛抗体。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的间接ELISA抗体检测试剂盒，其还包括酶标抗体稀释液、其中含有吐温的磷酸缓冲液、TMB显色液和终止液(2％的硫酸溶液)。
6.权利要求1-5中任一项所述的间接ELISA抗体检测试剂盒的制备方法，其包括：将包含有LSDV-ORF122蛋白的包被液包被于酶标板上，并封闭，得到包被有LSDV-ORF122蛋白的酶标
7.根据权利要求6所述的制备方法，其中所述包含有LSDV-ORF122蛋白的包被液的浓度为2-10μg/mL，可选为4-6μg/mL，进一步可选为6μg/mL；和/或
8.一种牛结节性皮肤病的间接ELISA抗体检测方法，其包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的牛结节性皮肤病的间接ELISA抗体检测方法，
10.一种牛结节性皮肤病的间接ELISA抗体检测的酶标板，其包被有LSDV-ORF122蛋白。
...【技术特征摘要】
1.一种牛结节性皮肤病的间接elisa抗体检测试剂盒，其包括：包被有lsdv-orf122蛋白的酶标板。
2.根据权利要求1所述的间接elisa抗体检测试剂盒，其中所述lsdv-orf122蛋白的氨基酸序列如序列表中seq id no:2所示。
3.根据权利要求1或2所述的间接elisa抗体检测试剂盒，其中所述lsdv-orf122蛋白的编码基因的核苷酸序列如序列表中seq id no:1所示。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的间接elisa抗体检测试剂盒，其还包括：样品稀释液、酶标二抗及显色底物；可选地，所述样品稀释液为1×pbs，所述酶标二抗为以hrp标记的山羊抗牛抗体。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的间接elisa抗体检测试剂盒，其还包括酶标抗体稀释液、其中含有吐温的磷酸缓...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘泽，赵明治，胡莉红，刘志龙，
申请(专利权)人：金宇保灵生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：
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