高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪瘟病毒同时定量检测试剂盒制造技术

本发明专利技术先提供了一种同时检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的特异性引物和探针组合，包括用于特异性扩增高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的1对特异性引物和1条与引物对配合使用的特异探针；以及用于特异性扩增猪瘟病毒的1对特异性引物和1条与引物对配合使用的特异探针。本发明专利技术还提供一种同时检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的检测试剂盒，其具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、可直接定量，无需标准曲线、操作简便等优点，可以在疫情预爆发前便于在早期内确定疫病，做好预防，从源头控制疫情。

【技术实现步骤摘要】
高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪瘟病毒同时定量检测试剂盒
本专利技术涉及试剂盒检测
，具体的说涉及一种能同时检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病病毒和猪瘟病毒双重微滴数字RT-PCR绝对定量检测试剂盒。
技术介绍
猪瘟是由猪瘟病毒(ClassicalSwineFeverVirus，CSFV)引起的一种高度接触性热性传染病，该传染性高，致病性强，猪是本病唯一的自然宿主，感染的病猪主要表现为特征性病理变化，内脏出血，梗塞和坏死，死亡率很高，给养猪业造成重大的经济损失。病猪是最主要的传染源，易感猪与病猪的直接接触是病毒传播的主要方式。在我国，猪瘟流行呈现典型猪瘟和非典型猪瘟共存、持续感染与隐性感染共存、免疫耐受和带毒综合征共存等形式；在国外，比利时、德国、荷兰最近爆发猪瘟也说明猪瘟流行形式发生了改变。猪瘟新的流行形式给全世界养猪业提出了新的挑战。CSFV与牛病毒性腹泻病毒(bovineviraldiarrheavirus，BVDV)和羊边界病毒(BorderDiseaseVirus，BDV)同属黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(pestivirus)。猪瘟病毒基因组为单股正链RNA长约12.3KB，含有一个大的开放阅读框架。病毒粒子呈球形，直径40-50nm，二十面体对称，其芯髓直径29-30nm，有囊膜。猪繁殖与呼吸综合征病是由猪繁殖与呼吸综合征病病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)引起的一种高度接触性传染病，在大多数国家中呈流行性感染。猪发病后临床表现差异极大，是该病的显著特征之一。临床症状主要是繁殖障碍，包括怀孕后期流产、早产和死胎，育成猪的呼吸道症状。发病母猪体温升高，厌食，部分患猪的背侧、双耳的耳尖及边缘呈红蓝色。发病公猪性欲减退，生产性能下降。发病仔猪出生时死亡或产出后个体小。患猪死亡后的主要病理变化是:眼球肿胀突出，头、臀部皮下水肿，胸腔、心包积水，心室扩张，心肌变化萎缩，肾脏皮质部点状出血，肺脏间质性肺炎病变。1991年病原首次鉴定，病毒是单链RNA病毒，属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，但是病毒的来源并未确定。1985年美国猪群猪繁殖与呼吸综合征病毒血清抗体的存在说明该病毒在发病之前就已经存在。2006年我国南方部分省份出现养猪场(户)暴发猪“高热病”疫情，发病猪以“高热”、“高发病率”和“高死亡率”为主要特征，给我国的养猪业造成了较大的经济损失。中国动物疫病预防控制中心田克恭等研究发现，猪“高热病”的主要致病病原为Nsp2缺失30个氨基酸的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异引起，后将其命名为“高致病性猪繁殖与呼吸综合征病”(Highlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，HP-PRRSV)，其致病性大大增加，仔猪发病率可达100％、死亡率可达50％以上，母猪流产率可达30％以上，育肥猪也可发病死亡。常规的猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病病毒的实验室检验方法是根据免疫反应原理，利用ELISA及双夹心ELISA法进行检测。目前，国内外已对猪瘟的结构蛋白基因进行了详尽的研究，国外有学者分别对CSFVAlfort株和BreSCia株基因进行了全序列测定，并通过免疫学方法证明囊膜糖蛋白El是CSFV诱导保护性中和抗体的重要抗原，而国内则对于石门株(Shimen)的基因序列进行了测定。通过RT-PCR技术将编码相应结构蛋白的mRNA反转录成cDNA，转入载体进行表达，并将表达产物进行纯化、定量以及作为抗原包板做ELISA进行感染检测。另外猪瘟兔化弱毒EZ蛋白A/D区的高效表达和蛋白纯化后亦可以作为包被抗原进行ELISA测定，但是由于不能区分自然感染的和免疫接种。PRRSV可以从各种临床样品中分离到，包括血清、血浆、外周血单核细胞、骨髓、扁桃体、肺脏、淋巴结、胸腺、脾脏、心、脑、肝、翠丸、附翠、输精管、尿道球腺、阴茎组织、口咽拭子、鼻甲、鼻拭子、胎盘、唾液、尿液、粪便以及精液中。一般来说，肺脏深处积液以及血清都是病毒分离最理想的材料。送检材料通常应包括新鲜采集的肺、扁桃体以及淋巴结。但是只有当特定滴度的标准病毒在新巨噬细胞生长良好，方可使用。冰冻切片免疫荧光抗体试验(IFA)以及免疫组化试验(IHC)可以检测组织中的PRRSV抗原。冰冻切片直接FA试验成本较低并且快速，这两种方法的特异性很高，但相对来说敏感性不够。样品的质量对FA结果影响非常大，要求组织应该新鲜。IHC可以检测甲醛固定的组织，比FA的敏感性要高，但更费时而且成本更高。通过组织病理学切片，结合IHC以及FA试验的结果可以对PRRSV感染做出准确的诊断。另外，针对上述两种病毒可以用RT-PCR技术进行检测。通常是用异硫氰酸肌一酚一仿一步抽提法提取病料细胞总RNA并进行反转录，再以此产物为模板对可疑的猪瘟或者猪繁殖与呼吸综合征病病料进行了PCR扩增。如果扩增出相应的片段则说明病毒的存在，敏感性要高于荧光抗体染色法、酶标单克隆抗体染色法和电镜负染法，可以作为一种有效的诊断方法。概括来说猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病病毒的检测方法主要包括免疫学检测方法和核酸检测方法两大类。免疫学方法主要是检测血清中是否存猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征病病毒的特异性抗体，具体是用ELISA的方法进行检测，然而这种方法必须是建立在已经发生病毒感染并产生抗体的基础上，而且鉴于上述病毒的高度变异性以及与其他病毒血清学的交叉性，其特异性难以保证，容易出现假阳性和假阴性。病毒分离和培养法比较敏感，但是这种方法操作繁琐，不宜在所有检测实验特别是一些基层实验室推广。用普通PCR的方法进行猪瘟或者猪繁殖与呼吸综合征病病毒核酸，虽然灵敏度有所提高，但是容易产生非特异性扩增，甚至会因为操作的原因出现假阳性，而且普通PCR扩增法其结果的判断需要对产物进行凝胶电泳分析，操作方法不够简化。为了对疾病的治疗和疫情在早期就有效控制,建立快速、敏感、准确的猪瘟与猪繁殖与呼吸综合征病病毒检测方法是十分必要的。近年荧光PCR技术在病毒等微生物检测领域得到广泛的应用,它利用PCR技术对DNA的高效扩增并结合探针技术的高特异性和敏感性,克服了常规血清学和普通PCR方法的不足,但是荧光PCR技术的检测下限仍很高，不能检测出微量的病毒，所以提出了数字PCR的概念。数字化PCR的概念早在1999年就由BertVogelstein采用并发表相关文献，其初衷是为了能够从临床样品(如尿液、淋巴液、血浆、粪便等)大量的正常体细胞中检测出微量的突变细胞，但由于当时能用于稀释样品的耗材只是384孔板，因此还不能非常好地体现数字PCR的核心理念——“无限稀释”(terminaldilution，有些文献上也称partition)。如今，数字PCR技术的浪潮已经来临，Bio-Rad公司的QX200系统核心的微滴化技术能够将一份样品分成20,000个纳升级的微滴，本质上将传统定量PCR的一个反应变成20,000个反应，大大提高了核酸序列检测的灵敏度和精准度，是对“无限稀释”这一概念的完美演绎。由于扩增前的微滴化处理步骤，使得该技术能够以绝对定量的方式直接“数”出靶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于同时检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的特异性引物和探针组合，包括用于特异性扩增高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的1对特异性引物和1条与引物对配合使用的特异探针，其核苷酸序列为：HP‑PRRSV‑F2：AGTGGGTCGGCACCAGTTC；HP‑PRRSV‑R2：CGCAGACAAATCCAGAGGCT；HP‑PRRSV‑P2：FAM‑AACTGTGACAACAACGCTGACGCA‑BHQ1；以及用于特异性扩增猪瘟病毒的1对特异性引物和1条与引物对配合使用的特异探针，其核苷酸序列为：CSFV‑F1：TTCAATTTGGTTCAGGGCCTCC；CSFV‑R1：TACTCAGGACTTAGACCACCCAGG；CSFV‑P1：HEX‑ATGCCCATAGTAGGACTAGCAAACGG‑BHQ1。

【技术特征摘要】
1.一种用于同时检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的特异性引物和探针组合，包括用于特异性扩增高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的1对特异性引物和1条与引物对配合使用的特异探针，其核苷酸序列为：HP-PRRSV-F2：AGTGGGTCGGCACCAGTTC；HP-PRRSV-R2：CGCAGACAAATCCAGAGGCT；HP-PRRSV-P2：FAM-AACTGTGACAACAACGCTGACGCA-BHQ1；以及用于特异性扩增猪瘟病毒的1对特异性引物和1条与引物对配合使用的特异探针，其核苷酸序列为：CSFV-F1：TTCAATTTGGTTCAGGGCCTCC；CSFV-R1：TACTCAGGACTTAGACCACCCAGG；CSFV-P1：HEX-ATGCCCATAGTAGGACTAGCAAACGG-BHQ1。2.权利要求1所述的特异性引物和探针组合在制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒同时检测试剂盒或检测试剂中的应用。3.一种含有权利要求1所述特异性引物和探针组合的试剂盒。4.如权利要求3所述的试剂盒，其为双重微滴数字RT-PCR绝对定量检测试剂盒。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包含病毒总RNA提取试剂和检测试剂；所述检测试剂包括无RNA酶的蒸馏水，一步法RT...

【专利技术属性】
技术研发人员：王林，冯小宇，郑淑芸，宋彦军，
申请(专利权)人：北京市动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：北京,11