密码子优化的严重发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白基因及其核酸疫苗制造技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，涉及密码子优化的严重发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白基因及其核酸疫苗。该密码子优化基因序列兼顾了哺乳动物细胞密码子使用偏好，序列如SEQ ID NO.2所示。所涉及的严重发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白核酸疫苗由密码子优化的严重发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白基因序列和真核表达载体pJW4303组成，其5’端连接tPA信号肽序列。该核酸疫苗在免疫哺乳动物后有效地刺激了免疫系统，产生了较好的体液免疫反应。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药
，涉及密码子优化及携带tPA信号肽的严重发热伴 血小板减少综合征病毒核蛋白基因序列及其核酸疫苗。
技术介绍
严重发热伴血小板减少综合征病毒（Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV)是一种最近在我国首先发现的属于布尼亚病毒科白蛉病 毒属的新的病毒，临床上可引起严重发热伴血小板减少综合征（Severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS)。到目前为止，在湖北、河南、江苏、辽宁、山东、安徽等 多个省份均有该病例报道。严重发热伴血小板减少综合征临床表现以发热、血小板减少、白 细胞减少为主，不易与其他发热和出血性疾病相鉴别，病死率可高达30%，且已有多篇关于 SFTSV人-人传播、聚集性发病的文献报道。因此，进一步研究该病毒致病机制并寻找合适 的诊断用抗体、中和保护性抗体已经迫在眉睫。 现有研究揭示SFTSV的基因组由大、中、小3个单股负链RNA片段组成。其中，小 片段含两个方向相反的读码框，分别编码核蛋白（NP)和非结构蛋白（NSs)。当前的研究结 果显示，一方面，该病毒入侵机体后能诱发宿主强烈的细胞因子风暴，且与疾病的严重程度 相关；另外一方面，中国疾病预防与控制中心等研究发现SFTS患者血清中的抗体主要针对 的是核蛋白，由此推测核蛋白暴露于病毒表面且其量丰富、免疫原性强，介导免疫损伤。基 于此，我们以核蛋白为靶抗原，构建其重组质粒进行核酸免疫，初步观察核蛋白的免疫原性 及体液免疫应答特点。核酸疫苗（nucleic vaccine)，又名基因疫苗（gene vaccine)或 DNA 疫苗（DNA vaccine)，其本质是含有抗原基因的真核表达载体被导入动物机体后为动物细胞所摄取并 表达相应的抗原蛋白，从而诱导机体对该蛋白的免疫反应。它具有如下优点：能够充分模拟 自然感染状态，在真核细胞内合成具有相应空间构象的蛋白，不仅可以激发机体产生体液 免疫反应还能够诱导产生特异性CD8+细胞毒性淋巴细胞（CTL)的免疫反应；与重组的病 毒活载体疫苗除了表达目的基因外还有其自身的许多蛋白要表达相比，核酸疫苗只有载体 上的抗原基因在细胞内得到表达，载体本身没有免疫原性，不会刺激机体产生抗体，能更好 的保证抗原蛋白的纯度；核酸疫苗能够避免直接接触危险性较高的病原体，并且可在DNA 水平对密码子进行优化、修饰，使其能够更高效地表达、更有效地刺激机体的免疫系统；而 且核酸疫苗成本低廉，稳定性好，适于大规模生产、运输、保存等。但核酸疫苗也存在着诸 多缺点，其中最主要的是核酸疫苗研究和应用的对象主要为真核生物，而目的基因绝大多 数来自于病毒或细菌等原核生物，而原核生物与真核生物在密码子使用偏好上存在明显差 异，这就导致了核酸疫苗的外源基因在真核细胞内不能高效地表达，不能有效地刺激机体 的免疫系统产生应答。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述缺陷，提供一种密码子优化的SFTSV核蛋白基因序 列。 本专利技术的另一目的是提供一种在优化基础上携带tPA信号肽的SFTSV核蛋白核酸 疫苗。 本专利技术的目的通过如下技术方案实现： -种密码子优化的SFTSV核蛋白基因序列，序列为SEQ ID N0. 2。原始SFTSV核蛋 白基因序列，序列为SEQ ID NO. 1。 SEQ ID NO. 2所示的密码子优化的严重发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白基因 序列在制备预防或治疗严重发热伴血小板减少综合征的药物中的应用。 一种SFTSV核蛋白核酸疫苗，由SEQ ID N0. 2所示的SFTSV核蛋白基因序列插入 到真核表达载体所得。 其中，所述的真核表达载体为真核表达载体为PJW4303。 其特征在于所述的SFTSV核蛋白核酸疫苗优选将SEQ ID N0. 2所示的SFTSV核蛋 白基因序列插入到真核表达载体PJW4303的Hind III和BamH I酶切位点之间所得。 所述的SFTSV核蛋白核酸疫苗优选将SEQ ID N0. 2所示的SFTSV核蛋白基因序列 插入到真核表达载体PJW4303的Nh e I和BamH I酶切位点之间所得，其5'端连接tPA信 号肽序列。 本专利技术提供的密码子优化的SFTSV核蛋白基因序列及其核酸疫苗的构建步骤如 下： (1)原始序列的SFTSV核蛋白基因序列核酸疫苗的构建 以HB29株为参考序列（GenBank:HM745932. 1)，选取其核蛋白编码基因N，由南京 金斯瑞生物科技有限公司合成并装入载体PUC57,构成pUC57-N。用Hind III和Bgl II双 酶切 pUC57_N，并用 DNA 凝胶回收试剂盒（Omega Agarose Gel DNA Purification Kit，美 国Omega公司）回收纯化目的片段，用于核酸疫苗的构建。 (2)密码子优化的SFTSV核蛋白基因序列的设计和合成 以HB29株为参考序列（GenBank:HM745932. 1)，首先选取SFTSV核蛋白基因，全长 738bp，然后运用软件OptimumGene?分析其基因序列，找出其密码子使用偏好同时找出与 哺乳动物密码子使用偏好不同的密码子位点，用哺乳动物偏好的密码子替代SFTSV核蛋白 基因中使用偏好不同的密码子，然后设计出密码子优化的SFTSV核蛋白基因序列，并由南 京金斯瑞生物科技有限公司化学合成得到该基因。密码子优化的基因序列所编码的蛋白质 氨基酸序列与原有的氨基酸序列保持一致。密码子优化后的SFTSV核蛋白基因序列为SEQ ID N0. 2,优化前的序列为SEQ ID N0. 1。 (3)对南京金斯瑞生物科技有限公司提供的含有目标序列的重组载体 pUC57-NP_opt 用 HindIII和 BamHI双酶切，用 DNA 凝胶回收试剂盒（Omega Agarose Gel DNA Purification Kit,美国Omega公司）回收纯化目的片段，该片段为密码子优化的 SFTSV核蛋白基因序列，两端分别连接有HindIII和BamHI酶切位点的基因序列，以便于 核酸疫苗的构建。 (4)对南京金斯瑞生物科技有限公司提供的含有目标序列的重组载体 pUC57-NP-〇pt,设计引物 tPA-N-oot-F :GTCACTTCGCTAGCTCCGAGTGGAGTAGAATCGC ： tPA-N-〇pt-R ：CGCGGATCCTCATTACAGGTTCCGATAAGCG〇 分别引入酶切位点 Nhe I 和 BamH I， PCR扩增密码子优化后的SFTSV核蛋白基因序列，扩增产物用Nhe I和BamH I双酶切，并用 DNA 凝胶回收试剂盒（Omega Agarose Gel DNA Purification Kit，美国 Omega 公司）回收 纯化目的片段，该片段为密码子优化的SFTSV核蛋白基因，两端分别连接有Nhe I和BamH I 酶切位点，以便于核酸疫苗的构建。 (5)将步骤⑴得到的基因片段克隆到真核表达载体PJW4303中，得到重组质粒 PJW4303-N。将步骤（3)得到的基因片段克隆到真核表达载体pJW4303中，得本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种密码子优化的严重发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白基因序列，其特征在于序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李军，金柯，周宜庆，韩亚萍，刘源，蒋龙凤，
申请(专利权)人：南京医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32