本发明专利技术公开了一种表达猪瘟病毒E2基因重组病毒及制备方法与应用，本发明专利技术根据密码子的偏爱性，将人工合成CSFV2.1型免疫原性基因E2基因和1.1型E2基因分别置于杆状病毒pH和p10启动子下表达，获得了一种重组杆状病毒，CCTCCNO:V201338，提高了外源基因的表达量。本发明专利技术的重组杆状病毒所表达E2蛋白制备亚单位疫苗，免疫日本大白兔和猪后，可诱导机体产生特异性免疫反应，并免受猪瘟病毒的攻击，同时可以通过鉴别诊断区分疫苗免疫和野毒感染动物，利于猪场猪瘟病毒的根除和净化。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于兽医生物
本专利技术涉及一种重组杆状病毒毒株的构建方法。具体涉及一种表达猪瘟病毒E2基因的重组杆状病毒Ac-CSE12的制备方法及其在预防猪瘟感染的亚单位疫苗中的应用。利用本专利技术的重组病毒表达人工修饰的猪瘟病毒E2基因，可以用于制备安全的猪瘟病毒亚单位疫苗。
技术介绍
猪瘟是(Classical swine fever,CSF)是由黄病毒科瘟病毒属猪瘟病毒(Classical swin e fever virus,CSFV)引起的一种高度接触性、出血性和致死性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。当前猪瘟在我国很多猪场流行，临床上表现为早产、流产、死胎、木乃伊胎及猪生产能力下降等。同时该病与伪狂犬病、圆环病毒感染相关疾病等多重感染和混合感染常常发生。但却没有有效的治疗药物，只能使用疫苗来免疫动物，达到预防疾病的目的。E2蛋白是诱导机体产生中和抗体的主要保护性抗原主要成分，可以抵抗强毒的攻毒保护实验(Weiland et al.,1990；Greise et al.，1990；Dong et al.,2006；Chen et al.,2011；Llilianne Gangesa et al.,2012)，是构建猪瘟新型基因工程疫苗的首选靶蛋白。利用CSFV E2蛋白制备的亚单位疫苗没有非结构蛋白，可以利用检测Erns蛋白的抗体来区分疫苗免疫和野毒感染猪群。目前，猪瘟的流行形势十分复杂。我国流行的猪瘟病毒基因亚型较多，包括2.1，2.2，2.3和1.1亚型；在1994年的台湾也出现基因3型的猪瘟病毒；其中基因2.1(尤其2.1b)亚型在我国广泛流行(涂长春，2004；Weihuan Fang et al.,2007；Luo Y et al.,2014)。尽管猪瘟兔化弱毒疫苗能有效的预防不同基因亚型病毒的感染，但是猪瘟仍在部分区域呈流行态势，并存在代毒与免疫临床发病现象。猪瘟作为我国优先防治的一类动物传染病，仍迫切需要便于鉴别诊断的新型基因工程标记疫苗以及配套的诊断试剂。 近年来，杆状病毒表达载体因其具有操作简单、安全性高，可容纳大的目的基因，表达外源蛋白效率高，有翻译后修饰的作用，表达蛋白的免疫原性、生物活性与天然的蛋白相似等优点,已经在表达载体上占了主导的地位(Anderson et al.,1995；Wang et al.,2001；Ribe iro et al.,2001)。利用杆状病毒表达载体同时表达CSFV 2.1型和1.1型的E2蛋白，制备亚单位疫苗，能同时预防I群和II群猪瘟病毒感染，也利于与野毒感染进行鉴别诊断。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供了一种包含了人工修饰合成的猪瘟病毒2.1型E2基因和1.1型E2基因的融合cDNA基因序列，其序列为SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白质为SEQ I D NO.2所示。 本专利技术的另一个目的是提供一种转移载体pFastBac2E2，该载体分别含有1个拷贝CSF V 2.1型和1.1型免疫原性基因E2基因的cDNA序列。 本专利技术还有一个目的就是提供一种表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒，该毒株被命名为Ac-CSE12，属于杆状病毒(Baculovirus)，该病毒含有CSFV 2.1型和1.1型免疫原性基因E2，该病毒于2013年9月9日送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO:V201338，分类命名：重组杆状病毒Recominant Autographa californica multiple Nucleopolyhedrovirus Ac-CSE12，地址：中国武汉武汉大学。 本专利技术还有一个目的是提供了一种猪瘟病毒重组杆状病毒Ac-CSE12的制备方法，该方法简单易行，适合大规模生产。 本专利技术还有一个目的是提供了一种猪瘟重组杆状病毒Ac-CSE12在制备亚单位疫苗中的应用，将该病毒免疫日本大白兔后可诱导机体产生特异性免疫反应，并能免受1.1型和2.1型的CSFV的攻击。重组杆状病毒表达E2蛋白制备亚单位疫苗免疫动物后，可以通过鉴别诊断区分疫苗免疫和野毒感染动物。 更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。 本专利技术的有益效果是： 1.本专利技术根据密码子的偏爱性，人工修饰合成了CSFV QZ-07毒株的免疫原性基因E2，提高了这些基因在杆状病毒中表达水平。 2.本专利技术是将人工合成CSFV 2.1型免疫原性基因E2基因和1.1型E2基因分别置于杆状病毒pH和p10启动子下表达，提高了外源基因的表达量。 3.本专利技术的重组杆状病毒所表达E2蛋白制备亚单位疫苗，免疫日本大白兔和猪后，可诱导机体产生特异性免疫反应，并免受猪瘟病毒的攻击。 4.本专利技术的重组杆状病毒表达E2蛋白制备亚单位疫苗免疫动物后，可以通过鉴别诊断区分疫苗免疫和野毒感染动物。 附图说明 图1为一种杆状病毒载体pFastBac2E2的酶切鉴定图谱。 M：5000bp DNA Marker；1:pFastBac2E2/BgLII酶切；2:pFastBac2E2/NHeI酶切 图2为一种重组杆粒rBac-CSE12PCR鉴定示意图。 鉴定正确的杆状病毒转移载体pFastBac2E2转化DH10Bac，蓝白斑筛选获得阳性菌落，提取杆粒rBac-CSE12进行PCR鉴定的电泳图片。 水：阴性对照M:15000bp；1、7:阴性对照M:15000bp DNA Marker；2：M13上游引物和2.1E2下游引物扩增(3800bp)；3～6：M13引物扩增(4800bp) 图3为一种Western blot分析杆状病毒Ac-CSE12蛋白表达的示意图； 1：杆状病毒Ac-CSE12感染sf9细胞；2：为感染的sf9细胞 图4为一种间接免疫荧光分析杆状病毒Ac-CSE12蛋白表达的示意图； a：观察红荧光，b：绿荧光，c：观察细胞核，d：a-c合在一起的图片 图5为重组杆状病毒Ac-CSE12表达E2蛋白的western blot定量分析 M：marker；1-3：CSFV E2蛋白；4-7：为倍比稀释的His标签蛋白(4：112μg/mL；5：56μg/mL；6：28μ本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种包含了人工修饰合成的猪瘟病毒2.1型E2基因和1.1型E2基因的融合cDNA基因序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种包含了人工修饰合成的猪瘟病毒2.1型E2基因和1.1型E2基因的融合cDNA基因序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述基因编码的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.2所示。
3.包含权利要求1所述基因的杆状病毒转移载体pFastBac2E2。
4.权利要求3所述杆状病毒转移载体pFastBac2E2的制备方法，具体如下：
1）.CSFV主要免疫原性基因E2的获得
参照CSFV QZ-07分离株E2基因序列，根据杆状病毒密码子的偏爱性人工合成1222bp 的E2基因序列，该序列克隆入载体pUC-18中获得重组质粒pUC-57-2.1-E2；
以质粒pMD-18T-CSFV-E2为模板，利用引物1.1E2-GZF： 5’-TTTTGGATCCACCATGCGGCTAGCCTGCAAG-3’ ；1.1E2-GZR：5’-TTTGCGGCCGCTTAGTGATGGTGATGGTGATGTTCTGCGAAGTAATCT-3’扩增993bp的E2基因，并在E2基因的C端引入6his序列作为标签；通过引物在基因片段的上下游引入BamHI和NotI酶切位点；将该片段连入pMD-18T载体，命名为pMD-18T-1.1E2；
2）.杆状病毒转移载体pFastBac2E2...
【专利技术属性】
技术研发人员：李祥敏，钱平，张华伟，朱世轩，钱苏红，陈焕春，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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