一种基于G‑四链体荧光特性的猪瘟病毒检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种基于G‑四链体荧光特性的猪瘟病毒检测方法及试剂盒，属于基因工程技术领域，其利用核酸等温扩增（NASBA）体系对目标RNA进行扩增得到单链的RNA产物；将上、下游探针和RNA扩增产物加入到G‑四链体荧光检测缓冲液中，经变性、退火后再加入原卟啉，利用酶标仪或荧光光度计检测该反应体系中荧光强度，可判定样品中有无猪瘟病毒存在。本发明专利技术检测猪瘟病毒速度快、精确稳定、重现性好、检测步骤简单、成本低廉。

【技术实现步骤摘要】
一种基于G-四链体荧光特性的猪瘟病毒检测方法及试剂盒
本专利技术涉及基因工程
，具体的说涉及一种基于G-四链体荧光特性的猪瘟病毒检测方法，及用于该猪瘟病毒检测方法的试剂盒。
技术介绍
猪瘟又称经典猪瘟，是由猪瘟病毒（一种RNA病毒）引起猪的一种急性或慢性、热性和高度接触性传染病。猪瘟呈世界性分布，严重危害养猪产业的发展。由于其危害性高，是国际重点检疫对象。在我国，每年由猪瘟导致的直接经济损失达数十亿元。目前，针对猪瘟病毒核酸的检测方法主要有荧光定量RT-PCR法。但这种诊断方法存在如试剂昂贵，容易污染，对操作人员要求较高，需要价格昂贵的荧光定量PCR扩增仪器等，严重阻碍了其在基层的应用。因此，如何快速、简便、准确的检出猪瘟病毒是猪瘟病原检测面临的主要难题之一。近些年来，DNA中存在的G－四链体结构引起了科学家广泛的兴趣。研究人员发现，G－四链体结构G－四链体结构能与Hemin类似结构的原卟啉（ProtoporphyrinIX）、锌卟啉（Zinc(II)-ProtoporphyrinIX）等结合产生荧光信号，可用于荧光检测。核酸等温扩增技术，即NASBA（Nucleicacids本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于G‑四链体荧光特性的猪瘟病毒检测方法，包括以下步骤：（1）NASBA扩增： 将纯化好的猪瘟病毒RNA样品加入到NASBA反应缓冲液体系中，体系包括0.5‑1μM正向引物和0.5‑1μM反向引物；反应步骤：65℃ 变性后降温，然后加入NASBA酶反应液进行等温扩增反应，条件为： 41℃90分钟，得到RNA扩增产物；其中：NASBA反应缓冲液体系包括NASBA反应缓冲液、NASBA正向引物和反向引物； NASBA反应缓冲液，包括：30‑60mM Tris‑HCl(PH8.0); 60‑80mM KCl；10‑30mM MgCl2；0.5‑2mM脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）; 0.5‑2...

【技术特征摘要】
1.一种基于G-四链体荧光特性的猪瘟病毒检测方法，此方法不用于疾病的诊断和治疗，包括以下步骤：（1）NASBA扩增：将纯化好的猪瘟病毒RNA样品加入到NASBA反应缓冲液体系中，体系包括0.5-1μM正向引物和0.5-1μM反向引物；反应步骤：65℃变性后降温，然后加入NASBA酶反应液进行等温扩增反应，条件为：41℃90分钟，得到RNA扩增产物；其中：NASBA反应缓冲液体系包括NASBA反应缓冲液、NASBA正向引物和反向引物；NASBA反应缓冲液，包括：30-60mMTris-HCl，PH8.0;60-80mMKCl；10-30mMMgCl2；0.5-2mM脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）;0.5-2mM核糖核苷三磷酸（NTPs）；5-20mM二硫苏糖醇；5-20%（v/v）二甲基亚砜（DMSO）；NASBA正向引物和反向引物，包括，0.5-1μM正向引物E2P7f：ACTATGAGCCCAGGGACAGCTACTT；0.5-1μM反向引物E2P7T7r：GTCGACTAATACGACTCACTATAGGGTTCCCTATCAACACTACCTCACCCT；NASBA酶反应液，包括：T7RNA聚合酶40-80U；AMV逆转录酶2-10U；RNaseH0.05-0.15U，0.5-5μg的牛血清白蛋白（BSA）；（2）G-四链体荧光检测反应：取G-四链体荧光检测反应缓冲液，反应缓冲液的组成包括上游探针0.5-2μM和下游探针0.5-2μM，加无菌双蒸水补足为96μl，加入2μl的RNA扩增产物；然后85℃变性3min后降温；加入原卟啉0.5-2μM，然后将溶液转移到96孔酶标板中，将酶标板放入酶标仪，以399nm波长的光源激发，检测610nm波长处发射的荧光；检测到的荧光强度高于3.0×107U即可判断为猪瘟病毒阳性；其中：G-四链体荧光检测反应缓冲液的组成包括：10mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，200mM的氯化钠和20mM的氯化钾；上游探针0.5-2μM和下游探针0.5-2μM；而上游探针E2-2-A：GCT...

【专利技术属性】
技术研发人员：王毅，邓明刚，鲁小璐，
申请(专利权)人：贵州大兴农业科技发展有限公司，王毅，
类型：发明
国别省市：贵州;52