本发明专利技术公开了南美白对虾对虾杆状病毒检测试剂盒及检测方法。本发明专利技术所述的南美白对虾对虾杆状病毒的PCR快速检测试剂盒，包括：2×反应混合缓冲液；优选设计的上、下游引物；Taq DNA聚合酶；阳性对照液；阴性对照液；ddH2O。本发明专利技术克服了现有对虾杆状病毒检测方法的不足，本发明专利技术对南美白对虾对虾杆状病毒进行临床诊断不仅切实可行，且具有快速、准确、特异的优点，满足了临床诊断的要求，为检测南美白对虾对虾杆状病毒提供了便利条件。
【技术实现步骤摘要】
南美白对虾对虾杆状病毒检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及引起南美白对虾（凡纳滨对虾）形成金字塔包涵体对虾杆状病毒特异性PCR快速检测试剂盒及检测方法，特别涉及一种南美白对虾对虾杆状病毒的基因检测试剂及检测方法，适用于南美白对虾对虾杆状病毒病流行病学监测、对虾杆状病毒的检测及基因工程技术等领域。
技术介绍
对虾杆状病毒（Baculoviruspenaei，BP），属杆状病毒科（Baculoviridae）。该病毒主要引起滨对虾属（如南美白对虾）、明对虾属（如中国对虾）、美对虾属、沟对虾属等在内的所有对虾品种感染发病，以幼体、仔虾和早期幼虾对病毒最敏感，可引起对虾幼体几乎100%死亡。对虾杆状病毒最早于墨西哥湾北部水域的桃红对虾（Penaeusduorarum）的肝胰腺中发现（Couch1974），主要分布在中美洲和南美洲沿太平洋地区，如厄瓜多尔、哥斯达黎加、巴拿马、美国的佛罗里达、密西西比、德克萨斯和夏威夷群岛等。对虾杆状病毒主要危害对虾的肝胰腺、中肠上皮细胞，并只在细胞核内复制，产生多个金字塔状的核内包涵体，少量包涵体在粪便中游离存在。对虾杆状病毒病毒粒子大小为74nm～270nm，为有囊膜的环状超螺旋双链DNA病毒，目前未见完整对虾杆状病毒基因序列分析的报道。近年，南美白对虾的养殖在我国得到了很大的发展，但随着养殖面积的扩大和养殖环境的恶化，其病害也越来越严重，对虾杆状病毒病现在只在个别池塘发生，整体危害还不大，但如果不提前防范任其发展，将对南美白对虾的生产带来不可估量的损失。我国2008年在农业部公告第1125号将其列为二类动物疫病。经对现有技术的文献检索发现，尚未专利技术与本专利技术的南美白对虾对虾杆状病毒特异性PCR快速检测试剂盒及检测方法、引物对有关的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种南美白对虾对虾杆状病毒特异性PCR检测方法，能快速、高效地用于对虾杆状病毒的检测。1.南美白对虾对虾杆状病毒的PCR快速检测试剂盒，所述试剂盒包括：（1）2×反应混合缓冲液1.0mL，包含以下成分：（2）检测引物的设计合成：根据GenBank中发布的对虾杆状病毒的基因序列，设计一对特异性检测引物，上游引物BP-F：5’-GATCTGCAAGAGGACAAACCT-3’，下游引物BP-R：5’-TGTTTGCTGATGTATTGGCCG-3’，浓度为10μM；（3）Taq酶5U/μL；（4）灭菌的ddH2O1.0mL；（5）阳性对照液：对虾杆状病毒基因组DNA；（6）阴性对照液：健康南美白对虾组织总DNA。2.根据权利要求1所述的试剂盒，采用试剂盒检测南美白对虾对虾杆状病毒的方法为：（1）对虾杆状病毒DNA的提取：取50-100mg的鳃和肌肉组织，加入600μL灭菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于-20℃冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离心10分钟，取上清，加入200μLTris-饱和酚，充分振荡混匀后，静置5分钟，然后12000rpm离心5分钟，取上清液加入等量的酚：氯仿：异戊醇抽提二次，取上清加入2倍体积的异丙醇，混匀后，静置10分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清后，加入1mL预冷的75%的乙醇，静置5分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用50μL的ddH2O溶解，即为试验用DNA模板，提取的DNA模板置于-70℃保存备用；（2）PCR反应体系：采用25μL的PCR反应体系，在0.2mLPCR反应管内分别加入2×反应混合缓冲液12.5μL，上游引物、下游引物各0.5μL，5U/μLTaqDNA聚合酶0.5μL，DNA模板3.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上；（4）PCR反应条件：94℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环35次；72℃延伸10分钟，最后4℃保存；（5）PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在1.5%琼脂糖凝胶（含溴化乙锭0.5μg/mL）上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小；（6）结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在380bp处出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为对虾杆状病毒阳性；若阳性对照可见目的条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的对虾杆状病毒。与现有技术相比，本专利技术所述的南美白对虾的病原对虾杆状病毒的特异性PCR快速检测试剂盒及其检测方法具有以下特点及优点：（1）通过最近几年南美白对虾的流行病学调查发现，目前南美白对虾的病害越来越严重，危害越来越大，除常见的白斑综合症病毒（WSSV）、桃拉病毒（TSV）、传染性皮下及造血器官坏死病毒（IHHNV）外，就连被我国列为二类传染性水生动物疾病的对虾杆状病毒（BP）病也逐渐增多。而本专利技术根据这个病毒的核苷酸序列设计出一对特异性引物，采用聚合酶链式反应（PCR）技术，对患对虾杆状病毒病和隐性感染的南美白对虾进行定性检测，经检测并测序验证，可用于对虾杆状病毒病的快速、高效地检测。（2）本专利技术提供了针对上述PCR优化的PCR反应液、反应体系和反应条件。反应时将反应液、酶、引物、模板和适量的水混合，整个反应所需要的时间在1.5个小时内即可完成。附图说明图1为感染对虾杆状病毒南美白对虾组织的PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为阴性对照（以阴性对照液作为模板）；标号2为阳性对照（以阳性对照液作为模板）；标号3为对虾杆状病毒感染南美白对虾组织样品；标号M为分子量标准DL2000（购自宝生物工程有限公司）；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。图2为对不同病原的PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为对虾杆状病毒；标号2为白斑综合症病毒；标号3为传染性皮下及造血器官坏死病毒；标号4为桃拉病毒；标号5为黄头病毒；标号6为肝胰腺细小病毒；标号7为传染性肌肉坏死病毒；标号8为副溶血弧菌；标号9为溶藻弧菌，标号M为分子量标准DL2000；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。图3为8尾南美白对虾组织样品的PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为阴性对照（以阴性对照液作为模板）；标号2为阳性对照（以阳性对照液作为模板）；标号3-10为8尾不同南美白对虾组织样品；标号M为分子量标准DL2000；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。图4为5份南美白对虾组织样品的PCR扩增结果。其中，横坐标中：标号1为阴性对照（以阴性对照液作为模板）；标号2为阳性对照（以阳性对照液作为模板）；标号3-7为5份不同地区南美白对虾组织样品；标号M为分子量标准DL2000；纵坐标中：bp为碱基对，2000、1000、750、500、250、100为对应片段的碱基对的数量。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步详细说明：实施例一：南美白对虾对虾本文档来自技高网...
【技术保护点】
南美白对虾对虾杆状病毒的PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括： （1）2×反应混合缓冲液1.0mL，包含以下成分： （2）检测引物：上游引物BP‑F：5’‑GATCTGCAAGAGGACAAACCT‑3’，下游引物BP‑R：5’‑TGTTTGCTGATGTATTGGCCG‑3’，浓度为10μM； （3）Taq酶 5U/μL； （4）灭菌的ddH2O 1.0mL； （5）阳性对照液：对虾杆状病毒基因组DNA； （6）阴性对照液：健康南美白对虾组织总DNA。
【技术特征摘要】
1.南美白对虾对虾杆状病毒的PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：(1)2×反应混合缓冲液1.0mL，包含以下成分：(2)检测引物：上游引物BP-F：5’-GATCTGCAAGAGGACAAACCT-3’，下游引物BP-R：5’-TGTTTGCTGATGTATTGGCCG-3’，浓度为10μM；(3)Taq酶5U/μL；(4)灭菌的ddH2O1.0mL；(5)阳性对照液：对虾杆状病毒基因组DNA；(6)阴性对照液：健康南美白对虾组织总DNA；采用试剂盒检测南美白对虾对虾杆状病毒的方法为：(1)对虾杆状病毒DNA的提取：取50-100mg的鳃和肌肉组织，加入600μL灭菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于-20℃冰箱反复冻融3次，6000rpm低温离心10分钟，取上清，加入200μLTris-饱和酚，充分振荡混匀后，静置5分钟，然后12000rpm离心5分钟，取上清液加入等量的酚：氯仿：异戊醇抽提二次，取上清加入2倍体积的异丙醇，混匀后，静置10分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清后，加入1mL预冷的75％的乙醇，静置5分钟，12000rpm离心10分钟，去掉上清，置于真空干燥箱干...
【专利技术属性】
技术研发人员：雷燕，戚瑞荣，
申请(专利权)人：广州金水动物保健品有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。