本发明专利技术提供一种用于猪瘟活疫苗的耐热冻干保护剂、制备方法及其应用，属于兽用生物制品制造技术领域。该保护剂，由以下质量百分含量的组分组成：菊糖0.2%～2.5%、葡聚糖0.5%～12%、聚乙烯吡咯烷酮1%～6%、乳糖0.5%～12%、蔗糖0.2%～6%、聚乙二醇0.05%～2.5%、组氨酸0.005%～0.6%、半胱氨酸0.05%～4%、DMEM培养基0.2%～4%，其余为注射用水。本发明专利技术还提供该耐热冻干保护剂制备方法及应用。本发明专利技术耐热冻干保护剂不含外源蛋白及明胶，避免了对动物的应激反应以及副作用，大大提高了疫苗的安全性，在冷冻干燥及储存过程中能够高效保护抗原活性，增加了疫苗的稳定性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于兽用生物制品制造
，尤其是涉及用于猪瘟活疫苗的耐热冻干保护剂、制备方法及其应用。
技术介绍
猪瘟(classical swine fever，CSF)俗称“烂肠瘟”，在欧美一些地区又称猪霍乱(hog cholera)、猪热病或古典猪瘟，是由黄病毒科瘟病毒属的猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一种急性、热性和高度接触性传染病，临床上以发病急、高热稽留、全身泛发性点状出血和脾梗死为主要特征。猪瘟的死亡率高，会给养猪业造成巨大的安全隐患和经济损失。1908年，匈牙利Hutyra制备了CSFV高免血清，它能产生较强的保护力，但由于高免血清的价格昂贵，获取较困难，而且有散播的危险，故各国学者转向了灭活疫苗研究。灭活疫苗也存在免疫剂量大、免疫期短、产生免疫力较慢、不能引发局部免疫、仅能皮下或肌肉注射以及成本较高等缺点，故逐渐被猪瘟弱毒疫苗所取代。1955年，我国成功研制的猪瘟兔化弱毒疫苗(即C株)，在世界范围内的猪瘟免疫防控及最终根除的过程中起到了至关重要的作用，是防控猪瘟使用最多的疫苗。市场上目前常见的猪瘟活疫苗有4种，均是以C株为基础，即猪瘟细胞活疫苗、猪瘟乳兔脾淋组织活疫苗、猪瘟成兔脾淋组织活疫苗和猪瘟-猪丹毒-猪肺疫三联苗。其中免疫效果较好的是猪瘟细胞活疫苗和猪瘟成兔组织脾淋苗，也是政府采购的专用猪瘟疫苗。目前常用的猪瘟活疫苗冻干保护剂组方简单，大多含有蔗糖、明胶、牛血清白蛋白、水解乳蛋白等成分，但临床上已发现注射冻干疫苗时由明胶和外源蛋白引起的过敏等副作用；此外，传统的的保护剂耐热性能差，需要在冷冻条件下-15℃才能长期保存。
技术实现思路
本专利技术针对现有用于猪瘟活疫苗的耐热冻干保护剂因含外源蛋白、明胶带来
副反应的问题，提供一种不含有外源蛋白和明胶、用于猪瘟活疫苗的耐热冻干保护剂，该耐热冻干保护剂在冷冻干燥及高温储存过程中能够高效保护抗原活性，而且对动物无刺激性和危害性，对猪安全。本专利技术的另一目的是提供耐热冻干保护剂的制备方法，该方法操作方便。本专利技术的再一目的是提供上述耐热冻干保护剂在制备猪瘟活疫苗方面的应用，制备的猪瘟活疫苗，能够耐受较高温度储存。本专利技术的目的采用如下技术方案实现。一种用于猪瘟活疫苗的耐热冻干保护剂，由以下质量百分含量的组分组成：菊糖0.2％～2.5％、葡聚糖0.5％～12％、聚乙烯吡咯烷酮1％～6％、乳糖0.5％～12％、蔗糖0.2％～6％、聚乙二醇0.05％～2.5％、组氨酸0.005％～0.6％、半胱氨酸0.05％～4％、DMEM培养基0.2％～4％，其余为注射用水。在本专利技术中，菊糖的聚合度为2～10，葡聚糖为Dextran-40或Dextran-70，聚乙烯吡咯烷酮为PVP K30或PVP K90，聚乙二醇为PEG 200～400。本专利技术还提供所述耐热冻干保护剂的制备方法，包括如下步骤：(1)将菊糖、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、乳糖、蔗糖、聚乙二醇溶于水，采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌；(2)将组氨酸、半胱氨酸和DMEM培养基溶于水，采用过滤法进行除菌；(3)将步骤(1)和(2)所得溶液混合，补足水，得到所述耐热冻干保护剂。本专利技术还提供所述耐热冻干保护剂在制备猪瘟活疫苗方面的应用以及采用所述耐热冻干保护剂制备的猪瘟活疫苗。本专利技术还提供猪瘟活疫苗的制备方法，包括如下步骤：将耐热冻干保护剂和猪瘟病毒液按体积比1:0.8～1.2混合，冷冻干燥后得到所述猪瘟活疫苗。在本专利技术中，所述冷冻干燥方法如下：将耐热冻干保护剂和猪瘟病毒液的混合物放在冻干机箱体内的隔板上，在常压、2～5℃条件下预冷20～40min，然后按照0.5～1℃/min的速度降温至-38～-42℃并维持3～5h；将冻干机的冷阱降至-48～-52℃，箱体内抽真空至300～400mTorr；然后将所述隔板以0.2～0.8℃/min的速度升温至-22～-28℃并维持14～18h，之后以0.1～0.4℃/min的速度升温至-12～-17℃并维持8～12h，最后以0.2～0.8℃/min升温至20～24℃并维持5～7h。与现有技术相比，本专利技术用于猪瘟活疫苗的耐热冻干保护剂的有益效果如下：本专利技术耐热冻干保护剂不含外源蛋白及明胶，避免了对动物的应激反应以及副作用，大大提高了疫苗的安全性。本专利技术耐热冻干保护剂在冷冻干燥及储存过程中能够高效保护抗原活性，有效解决了疫苗在保存、运输中的低温冷链问题，增加了疫苗的稳定性。采用本专利技术耐热冻干保护剂制备的猪瘟活疫苗，在2-8℃条件下至少能够储存36个月，在37℃条件下至少能够储存15天。因此，采用本专利技术耐热冻干保护剂制备的猪瘟活疫苗将大大降低失活风险，提高疫苗安全性。具体实施方式下述实施例仅对本专利技术作进一步详细说明，但不构成对本专利技术的任何限制。实施例1耐热冻干保护剂1耐热冻干保护剂1，由以下质量百分含量的组分组成：菊糖(聚合度(DP)为9)0.5％、葡聚糖(Dextran-70)5％、聚乙烯吡咯烷酮(PVP K30)3％、乳糖5％、蔗糖2％、聚乙二醇(PEG 200)1％、组氨酸0.3％、半胱氨酸1.5％、DMEM培养基(Gibco公司)3％，其余为注射用水。耐热冻干保护剂1的具体制备步骤如下：(1)称取菊糖(DP为9)、葡聚糖(Dextran-70)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP K30)、乳糖、蔗糖、聚乙二醇(PEG200)溶于少量注射用水中，高压蒸汽灭菌法灭菌30min，灭菌过程中控制温度为110℃，备用；(2)称取组氨酸、半胱氨酸和DMEM培养基溶于少量注射用水中，用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌后备用；(3)将步骤(1)和(2)制得的溶液混合，补足注射用水，得耐热冻干保护剂1。制备猪瘟活疫苗1：将耐热冻干保护剂1与猪瘟病毒液(C株，病毒含量40×104RID/mL)以体积比1：1混合，分装至7ml西林瓶中，2ml/瓶，用丁基四叉塞半加塞后，置入冻干机箱体内进行冷冻干燥，得到猪瘟活疫苗1。冷冻干燥的具体步骤为：将耐热冻干保护剂1与猪瘟病毒液的混合物放在冻干机箱体内的隔板上，在常压、4℃条件下预冷30min，然后按照1℃/min的速
度降温至-40℃，在-40℃维持4h；将冻干机的冷阱降至-50℃，冻干机箱体内抽真空至350mTorr；然后将隔板以0.5℃/min的速度升温至-25℃，在-25℃维持16h，之后以0.25℃/min的速度升温至-15℃，在-15℃维持10h，最后以0.5℃/min升温至20℃，在20℃维持5h。实施例2耐热冻干保护剂2耐热冻干保护剂2，由以下质量百分含量的组分组成：菊糖(DP为5)2％、葡聚糖(Dextran-70)10％、聚乙烯吡咯烷酮(PVP K90)2％、乳糖1％、蔗糖0.5％、聚乙二醇(PEG400)2％、组氨酸0.01％、半胱氨酸3％、DMEM培养基0.5％，其余为注射用水。耐热冻干保护剂2的具体制备步骤如下：(1)称取菊糖(DP为5)、葡聚糖(Dextran-70)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP K90)、乳糖、蔗糖、聚乙二醇(PEG400)溶于少量注射用水中，高压蒸汽灭菌法灭菌30min，灭菌过程中控制温度为110℃，备用；(2)称取组氨酸、半胱氨酸和本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于猪瘟活疫苗的耐热冻干保护剂，其特征在于由以下质量百分含量的组分组成：菊糖 0.2%～2.5%、葡聚糖 0.5%～12%、聚乙烯吡咯烷酮 1%～6%、乳糖0.5%～12%、蔗糖0.2%～6%、聚乙二醇 0.05%～2.5%、组氨酸0.005%～0.6%、半胱氨酸0.05%～4%、DMEM培养基0.2%～4%，其余为注射用水。
【技术特征摘要】
1.一种用于猪瘟活疫苗的耐热冻干保护剂，其特征在于由以下质量百分含量的组分组成：菊糖 0.2%～2.5%、葡聚糖 0.5%～12%、聚乙烯吡咯烷酮 1%～6%、乳糖0.5%～12%、蔗糖0.2%～6%、聚乙二醇 0.05%～2.5%、组氨酸0.005%～0.6%、半胱氨酸0.05%～4%、DMEM培养基0.2%～4%，其余为注射用水。2.根据权利要求1所述用于猪瘟活疫苗的耐热冻干保护剂，其特征在于菊糖的聚合度为 2～10，葡聚糖为Dextran-40或Dextran-70，聚乙烯吡咯烷酮为PVP K30或PVP K90，聚乙二醇为PEG 200～400。3.权利要求1或2所述耐热冻干保护剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）将菊糖、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、乳糖、蔗糖、聚乙二醇溶于水，采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌；（2）将组氨酸、半胱氨酸和DMEM培养基溶于水，采用过滤法进行除菌；（3）将步骤（1）和（2）所得溶液混合，补足水，得到所述耐热冻...
【专利技术属性】
技术研发人员：吕芳，赵艳红，卢宇，彭苗苗，邓碧华，张金秋，候继波，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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