猪免疫球蛋白Fc片段和猪瘟E2融合蛋白在CHO细胞株的构建方法及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域中的疫苗生产技术，具体涉及一种利用基因工程手段构建表达重组蛋白PigFC‑pigSCFVE2的CHO细胞株、及其制备方法和应用。本发明专利技术所提供的重组融合蛋白PigFC‑pigSCFVE2，为如下A1)或A2)：A1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；A2)在A1)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到具有PigFC‑pigSCFVE2活性的蛋白质。本发明专利技术获得的可以分泌表达PigFC‑pigSCFVE2的单克隆细胞株，融合蛋白表达量较高，经抗体亲和分离纯化所获得融合蛋白能和单抗结合，免疫动物且生成中和抗体高于目前市面产品，其融合蛋白可用于猪瘟预防疫苗，降低生产成本和免疫失败损失。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
中的疫苗生产技术，具体涉及一种利用基因工程手段构建表达重组蛋白PigFC-pigSCFVE2的CHO细胞株、及其制备方法和应用。
技术介绍
猪瘟俗称“烂肠瘟”，是由黄病毒科猪瘟病毒属的猪瘟病毒引起的一种急性、发热、接触性传染传染病，具有高度传染性和致死性。猪是该病毒唯一的自然宿主。该传染病于1833年首次发现于美国俄亥俄州，百余年来其流行遍及全球。国际兽疫局将其定为A类传染病，中国《动物防疫法》将其列为一类传染病，是目前危害中国养猪业发展的主要疫病之一。中国猪瘟兔化弱毒疫苗在防治猪瘟中曾起到决定性作用，但近几年来出现免疫效果不理想。CSFV为有囊膜病毒，40--60nm，单股正链RNA。CSFV基因组长约123kb，仅含有一个大的开放性阅读框架(ORF)，此ORF翻译成含3898个氨基酸残基，分子量约438kDa的多聚蛋白，并进一步在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下加工为成熟蛋白。cSFV的所有结构蛋白和非结构蛋白均由该ORF所编码，ORF两侧是5’一端非翻译区(5’-UTR)和3’一端非翻译区(3’-UTR)，且5’一端无帽子结构，3’一端无poly(A)尾巴。这一大前体蛋白以共翻译和后翻译的形式在细胞蛋白酶和病毒特异蛋白酶作用下加工成结构蛋白和非结构蛋白，其结构蛋白和非结构蛋白在病毒RNA上的编码顺序为Npro、c、Erns(E0)、E1、E2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。NS2-3可被加工成NS2、NS3(P80)，除c、E0、E1和E2为结构蛋白外，其余均为非结构蛋白。在结构蛋白中，最具有免疫防治研究价值的是E0和E2，尤其是E2蛋白是目前亚单位疫苗首选蛋白。E2蛋白为CSFV的另一囊膜糖蛋白，又称为gp55，是病毒主要的抗原蛋白，也是三个病毒糖蛋白中保守性最低、最易变异的分子。gp55常以100kDa的同源二聚体及与gp33形成75kDa的异源二聚体形式存在于病毒粒子及CSFV感染的细胞表面。在体外E2可诱导产生病毒的中和抗体，体内可诱导产生抗CSFV的攻击的抗体。Hulst用E2双相油包水乳剂免疫猪，能抵抗100LD50CSFVBrescia毒株强毒的攻击。gp55的蛋白骨架由370个氨基酸(ORF编码的690-1060氨基酸残基)组成，并以其C端的40个疏水氨基酸锚定在膜上。由于糖基化程度不同，E2的分子量可为51-58kDa。E2分子内的15个Cys残基在属内均保守，其中N端6个Cys残基参与抗原结构域的形成，C端9个Cys残基则参与同源、异源二聚体的形成。用基因工程的方法制备猪瘟亚单位疫苗主要集中在E2这个抗原区域，E2抗原疫苗也是目前控制该病的重要途径之一。尽管目前市场上已有大肠杆菌和杆状病毒等表达猪瘟E2抗原基因工程亚单位疫苗的供应，但人们仍在寻求新的低成本的长效猪瘟E2抗原疫苗的制备方法。具有完善翻译后修饰功能是哺乳动物细胞被选作大多数生物药蛋白表达宿主的主因。其中，中国仓鼠卵巢细胞(ChineseHamsterOvaryCell，简称CHO)是用于真核生物外源基因表达最为成功的宿主细胞，已有越来越多的药用蛋白在其中获得了高效表达，很多人用重组蛋白药物已上市。与其它表达系统相比，该系统具有许多优点，如拥有完备的翻译后加工过程，包括糖基化、羟基化，使表达的外源真核基因产物能够保持其天然结构及活性，且使表达产物分泌到胞外，有利于外源蛋白的分离纯化。IgG类的免疫球蛋白是血液中最丰富的蛋白质，它们的半衰期可高达21天，而FC片段是IgG保持体内较长半衰期的主要原因，同时具有稳定蛋白的作用。本专利技术将该猪FC片段和猪瘟E2抗原蛋白融合，其氨基酸序列从N端到C端依次包括猪FC片段、柔性肽接头和猪瘟E2抗原蛋白质，与现有猪瘟E2相比，克服在体内半衰期短且原核表达产物免疫活性低缺陷，其体内半衰期更长、免疫效果更好，只需要1次免疫且抗原免疫用量更少减少多次疫苗注射应激反应。本专利技术还涉及重组PigFC-pigSCFVE2融合蛋白组合物在抗猪瘟疫苗上用途。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何提高猪瘟E2蛋白质在大肠杆菌表达系统中免疫效果差；或其他表达系统表达产物抗体产生时间短以及原核内毒素残留引起免疫死亡的缺陷。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种稳定高效表达猪免疫球蛋白Fc片段和猪瘟E2抗原(CSFVE2)融合蛋白在CHO细胞株的构建方法。本专利技术获得的可以分泌表达PigFC-pigSCFVE2的单克隆细胞株，融合蛋白表达量较高，经抗体亲和分离纯化所获得融合蛋白能和单抗结合，免疫动物产生中和抗体高于目前市面产品，其融合蛋白可用于猪瘟预防疫苗，降低生产成本和免疫失败损失。本专利技术所提供的重组融合蛋白PigFC-pigSCFVE2，为如下A1)或A2)：A1)氨基酸序列如SEQIDNo.2所示的蛋白质；A2)在A1)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到具有PigFC-pigSCFVE2活性的蛋白质。为了使A1)或A2)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中SEQIDNo.2所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述A2)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加；或为不超过9个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加；或为不超过8个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加；或为不超过7个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加；或为不超过6个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加；或为不超过5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加；或为不超过4个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加；或为不超过3个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加；或为不超过2个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加；或为不超过1个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述A1)或A2)中的蛋白质可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A1)或A2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中SEQIDNo.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了与所述重组融合蛋白PigFC-pigSCFVE2相关的生物材料，为下述B1)-B5)中至少一种：B1)编码上述重组融合蛋白PigFC-pigSCFVE2的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；B5)含有B1)所述核酸分子的重组细胞系、含有B2)所述表达盒的重组细胞系、或含有B3)所述重组载体的重组细胞系。其中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组融合蛋白PigFC‑pigSCFVE2，为如下A1)或A2)：A1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；A2)在A1)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到具有PigFC‑pigSCFVE2活性的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种重组融合蛋白PigFC-pigSCFVE2，为如下A1)或A2)：A1)氨基酸序列如SEQIDNo.2所示的蛋白质；A2)在A1)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到具有PigFC-pigSCFVE2活性的蛋白质。2.根据权利要求1所述的重组融合蛋白PigFC-pigSCFVE2，其特征在于，在SEQIDNo.2所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接上选自如下组的标签：Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tagII、c-myc。3.根据权利要求1所述的重组融合蛋白PigFC-pigSCFVE2，其特征在于，所述A2)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。4.根据权利要求1所述的重组融合蛋白PigFC-pigSCFVE2，其特征在于，上述A1)或A2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中SEQIDNo.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上权利要求2所述的标签的编码序列得到。5.与所述重组融合蛋白PigFC-pigSCFVE2相关的生物材料，为下述B1)-B5)中至少一种：B1)编码上述重组融合蛋白PigFC-pigSCFVE2的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；B5)含有B1)所述核酸分子的重组细胞系、含有B2)所述表达盒的重组细胞系、或含有B3)所述重组载体的重组细胞系。6.根据权利要求5所述的生物材料，其特征在于，所述核酸分子是DNA，例如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子或是RNA，例如mRNA或hnRNA。7.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：李润，马广鹏，孙爱娟，李琳，史明，冯丽芳，杨丽聪，陈蕾，程水生，
申请(专利权)人：唐山怡安生物工程有限公司，北京中海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13