本发明专利技术提供了一种利用生物反应器制备兽用狂犬病灭活疫苗的方法，其是利用生物反应器和Cytodex-1微载体系统，用抗原性好的CTN-1株(aG株或PV株)狂犬病毒，对狂犬病毒CTN-1株(aG株或PV株)适应的高密度Vero细胞(或BHK细胞)进行病毒感染，使传统病毒收获期6-9天延长至11-15天，病毒滴度从105-7LD50/ml提高到108-9LD50/ml，病毒含量提高10～1000倍。将收获的病毒液灭活后，加入佐剂定量分装即可获得高质量的疫苗成品。制得的疫苗安全、有效，生产工艺稳定，质量可控。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种疫苗的制备方法，具体地说，涉及一种。
技术介绍
狂犬病俗称“恐水症”，是由狂犬病毒引起的人兽共患中枢神经系统传染病，临床表现以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁等为主要特征，是迄今为止人类唯一病死率高达100%的急性传染病。《中华人民共和国传染病防治法》将狂犬病列为乙类传染病。近年来我国犬、猫的饲养量快速增加，被犬、猫伤害的人数也不断增加。根据我国人用狂犬病疫苗的使用量，估计全国每年被动物伤害的人数超过4000万人。 狂犬病死亡人数占过去三年传染病死亡人数的30%。2008年I月18日，农业部和卫生部联合发文要求加强狂犬病疫苗免疫接种工作。在狂犬病疫苗品种的使用上，此前采用的是弱毒苗，在使用一段时期后，由于弱毒苗固有的弱点，其使用范围受到限制。目前我国狂犬病弱毒苗的生产存在手工操作密集，病毒株受限，细胞维持时间短，密度及活性低等问题，限制了产品产量、质量的提高且不利于降低生产成本。利用生物反应器技术培养狂犬病毒，用于制备疫苗逐渐受到人们的重视，
技术实现思路
本专利技术旨在克服已有的兽用狂犬病灭活疫苗制备方法中存在的不足，提供一种新型的、安全、有效的兽用狂犬病灭活疫苗的制备方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种，其是利用生物反应器和Cytodex-I微载体系统，用抗原性好的狂犬病毒株对密度为I 7 X 106/ml的该狂犬病毒株适应的Vero细胞或BHK细胞(优选Vero细胞)进行病毒感染，培养条件为34±2°C，pH值7 8，收获病毒培养液上清至细胞完全脱落为止，然后对收获的病毒液进行超滤浓缩和病毒灭活；其中，所述抗原性好的狂犬病毒株为狂犬病毒CTN-I株、aG株或PV株，优选CTN-I株。前述的方法，其中狂犬病毒CTN-I株、aG株或PV株对Vero细胞或BHK细胞进行病毒感染的接种比例为O. 03 O. 3M. O. I。优选地，使用丙内酯灭活病毒，使用量为丙内酯病毒液(V : V)=O.1-2 4000，更优选地，β-丙内酯病毒液(V : V) = I : 4000。前述的方法，其还包括最后向病毒灭活液中加入氢氧化铝胶和硫柳汞的步骤。优选地，氢氧化招胶和硫柳萊的终浓度分别为O. 1-0. 9mg/ml和O. lmg/ml。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果本专利技术利用生物反应器和Cytodex-I微载体系统，用抗原性好的CTN-I株(aG株或PV株)狂犬病毒，对狂犬病毒CTN-I株(aG株或PV株)适应的高密度Vero细胞(或BHK细胞)进行病毒感染，收获病毒液，使传统病毒收获期6-9天延长至11-15天，病毒滴度从IO5-7LD5tlAil提高到108-9LD5(l/ml，病毒含量提高10 1000倍。将收获的病毒液灭活后，力口入佐剂定量分装即可获得高质量的疫苗成品。制得的疫苗安全、有效，生产工艺稳定，质量可控。另外，与传统生产工艺相比，本专利技术改进了培养系统的氧传递方式，减少了剪切力，降低有害代谢废物浓度，由于此培养方式可模拟空间中的微重力环境，使培养物的重力向量在旋转过程中产生随机化，导致一定程度的重力降低，使细胞处于一种模拟自由落体状态，以此模拟微重力环境。由于没有搅拌剪切力影响，细胞可以在相对温和的环境中进行三维生长，同时在动物细胞培养过程中，葡萄糖代谢和谷氨酰胺代谢密切相关。通过控制葡萄糖和谷氨酰胺浓度可控制乳酸和氨等有害代谢物的产生浓度，可有效控制细胞生长状况。大规模培养高密度宿主细胞，细胞密度可达7X 106/ml，这种成本低、易于操作的细胞能量代谢转移研究方法，为实现高密度、高产率的细胞培养优化工艺提供了广阔的应用前景。附图说明图I为本专利技术方法制得的狂犬病疫苗的动物学免疫实验结果。·具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。以下实施例中使用的非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)购自ATCC, Cytodex-I微载体购自Amersham公司，狂犬病毒CTN-I株购自中国药品生物制品检定所。实施例I狂犬病毒CTN-I株适应的Vero细胞传代扩增培养将狂犬病毒CTN-I株毒种按O. 5%的比例接种于Vero细胞，置34. O±2. (TC培养，收获上清液，冻存，并按相同方法在Vero细胞上连续传代。采用小鼠脑内接种法测定病毒滴度达到IO8LD5tlAil以上，说明CTN-I株病毒对Vero细胞敏感。实施例2利用生物反应器和Cytodex-I微载体系统进行Vero细胞培养生物反应器工作体积IOL 500L，Cytodex-I微载体系统使用10g/L，细胞密度由5 X IO5 递增至Ij 5 7 X IO6。实施例3接种狂犬病毒CTN-I株对Vero细胞进行病毒感染CTN-I株狂犬病毒感染Vero细胞后，根据测定培养基(含有1_5%牛血清的标准MEM培养基)中葡萄糖浓度、乳酸盐浓度、谷氨酰胺、耗氧速率以及pH值指标来控制Vero细胞的生长；病毒培养温度34. O±2. 0°C，pH值7 8，溶氧10-100%，搅拌速度10 100转/分。实施例4病毒液的超滤浓缩、灭活及疫苗成品的制备接毒后开始收获含有狂犬病毒的培养液，采用100_300kDa超滤膜包进行超滤浓缩，按O. l-2ml/4000ml病毒液的量加入β -丙内酯进行灭活。然后，向病毒灭活液中加入终浓度为O. 1-0. 9mg/ml氢氧化铝胶和O. lmg/ml硫柳汞，充分摇匀，经灌装后即为狂犬病灭活疫苗成品。实施例5本专利技术兽用狂犬病灭活疫苗的制备I病毒与细胞用于制备狂犬病灭活疫苗的病毒株为具有良好抗原性的CTN-I株，以对该病毒株具有良好敏感性的细胞系Vero细胞，作为制苗用细胞系，以感染并大量繁殖狂犬病毒。2毒种制备 将制备疫苗用的细胞系VeiO细胞接种到含10%新生牛血清的标准MEM培养基中，Cytodex I微载体浓度为10g/L，在温度37. O ±2. (TC，pH值7_8，搅拌速度40转/分条件下培养。待微载体上的VeiO细胞长成单层，弃去生长液，按O. 5%的比例接种基础毒种，在34. 0±2. (TC条件下进行培养，接种病毒后收获上清液。采用小鼠脑内接种法测定病毒滴度大于108_°LD5(l/ml，表明病毒适应VeiO细胞，按照上述方法进行病毒传代，病毒滴度均大于108_°LD5(l/ml，即完成狂犬病毒适应Veix)细胞的传代，可用于建立病毒基础毒种和生产毒种。3连续的细胞培养Vero细胞接种到装有浓度为10g/L的Cytodex I微载体的生物反应器中，采用含有10%牛血清的标准MEM培养基培养7天，温度37. O±2. 0°C，pH值7-8，溶氧10-100%，搅拌速度10 100转/分。4连续收获感染病毒Vero细胞中接种O. 5%比例的生产用毒种，采用含有2_5%牛血清的标准MEM培养基，于34. O±2. 0°C，pH为7-8，溶氧10-100%，搅拌速度10 100转/分培养，连接程序控制软件，通过计算机在线监控。接种病毒后开始收获上清液，直至细胞完全脱落为止。收获液病毒含量可达108_°LD5Q/ml以上。5病毒浓缩灭活每批收获病毒液澄清后，超滤浓缩，按lml/4000ml病毒液的量加入β-丙内酯。在4°C下灭活病毒24小时，将灭活后的病毒置于3本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用生物反应器制备兽用狂犬病灭活疫苗的方法，其特征在于，其是利用生物反应器和Cytodex?1微载体系统，用抗原性好的狂犬病毒株对密度为1～7×106/ml的该狂犬病毒株适应的Vero细胞或BHK细胞进行病毒感染，培养条件为34±2℃，pH值7～8，收获病毒培养液上清至细胞完全脱落为止，然后对收获的病毒液进行超滤浓缩和病毒灭活；其中，所述抗原性好的狂犬病毒株为狂犬病毒CTN?1株、aG株或PV株。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：岳雷，李淑芬，陈静，郭鑫，韩中山，张振山，
申请(专利权)人：唐山怡安生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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