本发明专利技术涉及一种用于动物用灭活疫苗的乳化方法。本发明专利技术技术突破了乳化后按国家标准检测无分层，但放置于2～8℃保存时易分层的瓶颈，先分别以低免胚制备三种抗原，混匀三种抗原后灭活，并加入甘氨酸和硫柳汞作为水相，不同比例的白油、吐温‑80和司本‑80混匀后过滤除菌作为油相，水相油相经低温剪切乳化后，粒径D90小于等于1.0，黏度值为10～100cP，2～8℃保存24个月后，所制备的三联灭活疫苗未发现分层，效力检验合格。说明本发明专利技术可以制备出稳定、均一、安全、高效的新城疫、传染性支气管炎和禽流感H9亚型三联灭活疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于动物用灭活疫苗的乳化方法，属于动物生物制品领域。
技术介绍
新城疫、传染性支气管炎和禽流感H9亚型三种疾病近年来的爆发，成为危害养鸡业健康发展的三大重要传染病，每年给养禽业都造成了巨大的经济损失。而疫苗是这三大疫病最重要有效的防控手段。新城疫A-VII株和禽流感WJ57株是现流行毒株的代表株，传染性支气管炎M41是经典疫苗株，相应单苗、联苗及三联苗的面世，对于三大疫病的防控都将具有积极的社会与经济意义。但在灭活疫苗的制备过程当中，乳化工序中乳化剂的选择、配方和乳化方式不合适，均可导致灭活疫苗剂型不稳定，不仅影响外观及临床应用效果，严重的会破乳，产生不可逆的性状改变，导致疫苗无法使用。乳化完成后，按照中国兽药典的方法：取10ml疫苗，以3000r/min离心15min，不分层为合格。刚乳化完成的悬乳液，用此法检测时极少会出现分层或破乳，但在2～8℃保存7～30天左右会出现分层现象。为解决乳化后保存在2～8℃条件下疫苗分层的现象，本专利技术拟用新的乳化剂配方和乳化方式，合适的亲水亲油值，在低温状态下进行乳化，制备出稳定、均匀、安全和高效的预防新城疫、传染性支气管炎和禽流感(H9亚型)相关灭活疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的在于突破乳化后易分层的问题，提供一种用于动物用灭活疫苗的乳化方法。该方法可以制备出稳定、均匀、安全和高效的动物用灭活疫苗。使其粒径D90小于等于1.0，黏度值为10～100cP，且在2～8℃条件下，保存24个月不分层，效力检验合格。对于新城疫(A-VII株)、禽流感(WJ57株)、传染性支气管炎(M41株)灭活疫苗及相应联苗的大规模生产中的重要环节乳化来说，是个非常大的改进和突破。为了实现上述指标，本专利技术采取了如下技术方案：一种用于动物用灭活疫苗的乳化方法，该方法包括如下步骤：(1)新城疫病毒A-VII株：毒种用无菌PBS做适当稀释，尿囊腔接种9～11日龄低免鸡胚，每胚103.0～106.0EID50/0.1ml。选接种后48～96小时死亡的鸡胚，置2～8℃冷却12～24小时，收获鸡胚液于专业灭菌容器中，每0.1ml病毒液的病毒含量≥108.5EID50，备用；传染性支气管炎病毒M41株：毒种用无菌PBS做适当稀释，尿囊腔接种9～11日龄低免鸡胚，每胚102.0～104.0EID50/0.1ml。选接种后24～48小时死亡的鸡胚，置2～8℃冷却12～24小时，收获鸡胚液于专业灭菌容器中，每0.1ml病毒液的病毒含量≥106.5EID50，备用；禽流感H9亚型病毒WJ57株：毒种用无菌PBS做适当稀释，尿囊腔接种9～11日龄低免鸡胚，每胚103.0～106.0EID50/0.1ml。选接种后48～72小时后的鸡胚，置2～8℃冷却12～24小时，收获鸡胚液于专业灭菌容器中，每0.1ml病毒液的病毒含量≥108.5EID50，备用；(2)将上述收获的新城疫病毒抗原、传染性支气管炎病毒抗原和禽流感H9亚型病毒抗原以一定的比例混合成水相，加入浓度为0.1％～0.25％的甲醛，于37℃，1000～2000r/min搅拌，灭活16～24小时；(3)灭活完成后，加入甘氨酸和硫柳汞，混匀成水相；(4)将白油，吐温-80和司本-80按一定比例混合成油相，无菌过滤；(5)乳化容器放置于冰浴中，在容器中加入油相3份，2000r/min剪切搅拌，在剪切过程中缓慢加入1份水相，当水相加完后，搅拌剪切的速度调整至5000～9000r/min，搅拌5～10min；(8)乳化完成后，测定粒径和黏度；(9)在2～8℃保存24个月后，所制备的三联灭活疫苗未发现分层，效力检验合格。2.权利要求1所述一种用于动物用灭活疫苗的乳化方法，其特征在于该方法用于制备单一抗原成分的灭活疫苗和两种抗原成分的二联灭活疫苗。具体实施方式本专利技术采用低免胚作为制备抗原的鸡胚，新城疫病毒A-VII株、传染性支气管炎病毒M41株、禽流感H9亚型病毒WJ57株作为种毒，分别制备抗原，将三种抗原以1:1:1的比例混合后灭活，在抗原混合液中加入甘氨酸和硫柳汞作为水相，不同比例的白油、吐温-80和司本-80混匀后过滤除菌，作为油相，3份油相与1份水相在冰浴条件下进行剪切乳化，并包括如下步骤：(1)抗原制备新城疫病毒A-VII株：毒种用无菌PBS做适当稀释，尿囊腔接种9～11日龄低免鸡胚，每胚103.0～106.0EID50/0.1ml。选接种后48～96小时死亡的鸡胚，置2～8℃冷却12～24小时，收获鸡胚液于专业灭菌容器中，每0.1ml病毒液的病毒含量≥108.5EID50，备用；传染性支气管炎病毒M41株：毒种用无菌PBS做适当稀释，尿囊腔接种9～11日龄低免鸡胚，每胚102.0～104.0EID50/0.1ml。选接种后24～48小时死亡的鸡胚，置2～8℃冷却12～24小时，收获鸡胚液于专业灭菌容器中，每0.1ml病毒液的病毒含量≥106.5EID50，备用；禽流感H9亚型病毒WJ57株：毒种用无菌PBS做适当稀释，尿囊腔接种9～11日龄低免鸡胚，每胚103.0～106.0EID50/0.1ml。选接种后48～72小时后的鸡胚，置2～8℃冷却12～24小时，收获鸡胚液于专业灭菌容器中，每0.1ml病毒液的病毒含量≥108.5EID50，备用；(2)灭活将上述收获的新城疫病毒抗原、传染性支气管炎病毒抗原和禽流感H9亚型病毒抗原以一定的比例混合成水相，加入浓度为0.1％～0.25％的甲醛，于37℃，1000～2000r/m搅拌，灭活16～24小时；(3)水相灭活完成后，加入甘氨酸和硫柳汞，混匀成水相；(4)油相将白油，吐温-80和司本-80按一定比例混合成油相，无菌过滤；(5)乳化乳化容器放置于冰浴中，在容器中加入油相3份，2000r/min剪切搅拌，在剪切过程中缓慢加入1份水相，当水相加完后，搅拌剪切的速度调整至5000～9000r/min，搅拌5～10min；(8)测定乳化完成后，测定粒径和黏度；(9)保存期在2-8℃保存24个月后，所制备的三联灭活疫苗未发现分层，效力检验合格；本专利技术所述新城疫病毒毒株为A-VII株，传染性支气管炎毒株为M41株，禽流感病毒毒株为WJ57株；本专利技术所述甘氨酸浓度为0.1％～1.0％，硫柳汞的浓度为0.1％～1.0％。本专利技术所述油相中白油含量为70％～85％，吐温-80含量为12.5％～20％，司本-80的含量为2.5％～10％；本专利技术所述油相与水相比例为3:1，亲水亲油值为6.7～7.6之间；本专利技术所述乳化后的均匀乳液粒径D90小于等于1.0，黏度值为10～100cP。附图说明图1本专利技术乳化后疫苗测定的D90为0.46μm。图2疫苗性状(2-a：常规乳化工序；2-b：本专利技术乳化工序)。图中显示：2～8℃保存24个月的检验结果所制备的三联灭活疫苗未发现分层(图2b)、效力检验合格。本专利技术所涉及的生物材料资源信息本专利技术所述新城疫病毒(Newcastilediseasevirus)基因VII型新城疫病毒致弱株A-NDV-VII(CGMCCNO.2141)，本专利技术称：A-VII株，购自扬州大学，(参见：中国专利：ZL200710131863，基因Ⅶ型新城疫病毒致弱株A-NDV本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于动物用灭活疫苗的乳化方法，其特征在于该方法包括如下步骤：(1)新城疫病毒A‑VII株：毒种用无菌PBS做适当稀释，尿囊腔接种9～11日龄低免鸡胚，每胚103.0～106.0EID50/0.1ml。选接种后48～96小时死亡的鸡胚，置2～8℃冷却12～24小时，收获鸡胚液于专业灭菌容器中，每0.1ml病毒液的病毒含量≥108.5EID50，备用；传染性支气管炎病毒M41株：毒种用无菌PBS做适当稀释，尿囊腔接种9～11日龄低免鸡胚，每胚102.0～104.0EID50/0.1ml。选接种后24～48小时死亡的鸡胚，置2～8℃冷却12～24小时，收获鸡胚液于专业灭菌容器中，每0.1ml病毒液的病毒含量≥106.5EID50，备用；禽流感H9亚型病毒WJ57株：毒种用无菌PBS做适当稀释，尿囊腔接种9～11日龄低免鸡胚，每胚103.0～106.0EID50/0.1ml。选接种后48～72小时后的鸡胚，置2～8℃冷却12～24小时，收获鸡胚液于专业灭菌容器中，每0.1ml病毒液的病毒含量≥108.5EID50，备用；(2)将上述收获的新城疫病毒抗原、传染性支气管炎病毒抗原和禽流感H9亚型病毒抗原以一定的比例混合成水相，加入浓度为0.1％～0.25％的甲醛，于37℃，1000～2000r/min搅拌，灭活16～24小时；(3)灭活完成后，加入甘氨酸和硫柳汞，混匀成水相；(4)将白油，吐温‑80和司本‑80按一定比例混合成油相，无菌过滤；(5)乳化容器放置于冰浴中，在容器中加入油相3份，2000r/min剪切搅拌，在剪切过程中缓慢加入1份水相，当水相加完后，搅拌剪切的速度调整至5000～9000r/min，搅拌5～10min；(8)乳化完成后，测定粒径和黏度；(9)在2～8℃保存24个月后，所制备的三联灭活疫苗未发现分层、效力检验合格。...
【技术特征摘要】
1.一种用于动物用灭活疫苗的乳化方法，其特征在于该方法包括如下步骤：(1)新城疫病毒A-VII株：毒种用无菌PBS做适当稀释，尿囊腔接种9～11日龄低免鸡胚，每胚103.0～106.0EID50/0.1ml。选接种后48～96小时死亡的鸡胚，置2～8℃冷却12～24小时，收获鸡胚液于专业灭菌容器中，每0.1ml病毒液的病毒含量≥108.5EID50，备用；传染性支气管炎病毒M41株：毒种用无菌PBS做适当稀释，尿囊腔接种9～11日龄低免鸡胚，每胚102.0～104.0EID50/0.1ml。选接种后24～48小时死亡的鸡胚，置2～8℃冷却12～24小时，收获鸡胚液于专业灭菌容器中，每0.1ml病毒液的病毒含量≥106.5EID50，备用；禽流感H9亚型病毒WJ57株：毒种用无菌PBS做适当稀释，尿囊腔接种9～11日龄低免鸡胚，每胚103.0～106.0EID50/0.1ml。选接种后48～72小时后的鸡胚，置2～8℃冷却12～24小...
【专利技术属性】
技术研发人员：何海蓉，王正春，陈坚，王秋娟，
申请(专利权)人：中崇信诺生物科技泰州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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