一种水貂出血性肺炎灭活疫苗制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种水貂出血性肺炎灭活疫苗制备方法，还涉及一种上述制备方法所制得的灭活疫苗，还涉及一种上述灭活疫苗的应用。所述灭活疫苗的制备方法包括以下步骤：(1)培养分离鉴定的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9；(2)灭活处理：向菌液中缓慢加入甲醛灭活；(3)配苗：将灭活检验合格的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9菌液离心，取上清液，向上清液中加入饱和硫酸铵溶液，离心，将沉淀的蛋白质用无菌生理盐水溶解，调整多组份蛋白浓度为500ug/ml，加入佐剂。本发明专利技术的优点是免疫范围广，降低成本，减少免疫接种次数从而减少应急，增加经济收入的效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于动物疾病防治
，尤其涉及一种水貂出血性肺炎灭活疫苗制备方法，还涉及一种上述制备方法所制得的灭活疫苗，还涉及一种上述灭活疫苗的应用。
技术介绍
水貂出血性肺炎是由铜绿假单胞菌(又称绿脓杆菌，Pseudomonasaeruginosa)感染引起的一种高度致死性传染病，又称铜绿假单胞菌肺炎，多发于每年7至9月份，以水貂出血性肺炎、败血症为主要特征，发病急，死亡快，常呈地方性暴发流行，致死率极高。本病世界各地均有发生，是危害水貂养殖业的重要传染病之一。该菌可通过患病水貂形成的飞沫及气溶胶传播，以呼吸困难、口鼻出血、突发性死亡为主要特征，死后典型症状为口鼻流出血样泡沫，剖检肺脏呈弥漫性出血。铜绿假单胞菌，又称绿脓杆菌，属于γ变性菌门假单胞菌科，为需氧或兼性厌氧菌的革兰氏阴性杆菌。目前对铜绿假单胞菌分型常用方法是血清学分型，国际血清分型系统根据菌体O抗原将其分为20个不同的血清型。日本科学家Homma根据O抗原将铜绿假单胞菌分为A～N群，并且根据此系统形成的试剂盒在国际社会形成广泛应用。铜绿假单胞菌为条件致病菌，广泛存在于环境中，接种疫苗是预防该病的有效方法，同时避免了使用抗生素导致菌株产生耐药性。目前铜绿假单胞菌疫苗主要针对人医领域，在兽医领域较少，而且针对水貂出血性肺炎的灭活疫苗仅仅局限于区域流行B型G型的二联苗。因此开发出一种免疫范围广的水貂出血性肺炎肺炎疫苗以解决血清型问题、减少免疫接种次数从而减少免疫应急具有重要的现实意义和经济意义。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种免疫范围广的水貂出血性肺炎灭活疫苗的制备方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：一种水貂出血性肺炎灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：(1)培养分离鉴定的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9：将分离鉴定的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9接种于LB琼脂培养基，无菌环境下挑选单菌落于液体培养基中，培养至细菌培养液在OD600处的吸光度值为0.6～0.8之间，再37℃扩大培养12h，然后25℃避光静止培养三天以上直至呈绿色荧光；(2)灭活处理：向铜绿假单胞菌菌液中缓慢加入甲醛灭活，边加入边震荡，使其充分混匀，直至甲醛溶液的终浓度为菌液体积总量的0.4％，置于37°摇床震荡处理，摇床转速160-180r/min，灭活处理72小时，涂板检验菌液是否彻底灭活；(3)配苗：将灭活检验合格的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9菌液离心，取上清液，向上清液中加入饱和硫酸铵溶液，使上清液中的蛋白质沉淀，离心，取沉淀的蛋白质，将沉淀的蛋白质用无菌生理盐水溶解，调整多组份蛋白浓度为500ug/ml，加入佐剂，4度过夜，即得。铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9是通过大连瓦房店水貂养殖区临床分离得到(任何公众均可通过常规手段分离获得)，这是通过提取测序比对得知。本专利技术中，上清液疫苗的蛋白浓度是通过BCA蛋白定量试剂盒检测，BCA蛋白定量试剂盒购自Thermo公司。为检验本专利技术的步骤(1)所得的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9的上清液的毒性情况，将离心的上清液0.05ml小鼠皮下多点注射，实验结果为小鼠3天后均出现死亡。通过蛋白电泳可以观察到离心的上清液中有多种组分蛋白。将本专利技术步骤(2)所得的灭活后的上清液室温培养72小时后取适量灭活后的上清液涂布LB固体培养基，检验是否有铜绿假单胞菌存活。将本专利技术步骤(2)所得的灭活后的上清液室温培养72小时后取适量灭活后的上清注射到昆明小鼠腿部肌肉，检测上清液中的毒素蛋白是否完全灭活。结果表明，本专利技术步骤(2)所得的灭活后的上清液中无铜绿假单胞菌存活，步骤(2)所得的灭活后的上清液中的毒素蛋白已完全灭活。进一步地，步骤(3)中的佐剂为基于铝的佐剂，优选地，所述基于铝的佐剂为氢氧化铝胶体佐剂，可购自Sigma公司。具体地，氢氧化铝胶体佐剂的终浓度为0.5mg/ml。本专利技术还公开了一种上述制备方法所制得的水貂铜绿假单胞菌上清液灭活疫苗。目前防治水貂铜绿假单胞菌的疫苗都是以菌体作为灭活疫苗研发二联苗，而且针对水貂出血性肺炎的灭活疫苗仅仅局限于区域流行的B型G型的二联苗制备来减少免疫应急。由于铜绿假单胞菌上清液释放有脓杆菌合成或分泌的可溶性毒性产物如外毒素A、胞外酶(S、T、U和Y等)、蛋白酶、色素、耐热溶血素、杀细胞素、磷脂酶C等，本专利技术以铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9的上清液代替菌体，极大解决了血清型差异问题，具有免疫范围广，降低成本，减少免疫接种次数从而减少应急，增加经济收入的效果。本专利技术还公开了一种上述制备方法所制得的上清液灭活疫苗在防治水貂出血性肺炎中的应用：肌肉注射本专利技术的上清液多组分蛋白灭活疫苗，免疫剂量按照500ug每只。为检验本专利技术所制得的上清液灭活疫苗的安全性，进行了安全性检查：将本专利技术所制得的水貂铜绿假单胞菌上清液灭活疫苗分别免疫小鼠和水貂，三天后观察，结果无任何临床症状。抗体检测：特异性抗体水平检测、特异性分泌细胞检测结果表明，本专利技术所制得的铜绿假单胞菌上清液多组份蛋白灭活疫苗与常规的菌体灭活疫苗特异抗体水平无显著差异，特异性分泌细胞无显著差异。为检验本专利技术所制得的上清液灭活疫苗的免疫保护效力，进行了保护率实验，结果表明，在感染铜绿假单胞菌15天后，铜绿假单胞菌上清液多组份疫苗免疫水貂存活率100％。应用发病率：实验于诸城市大森林特种动物养殖区进行，实验结果表明，本专利技术的上清液多组份致病蛋白疫苗对水貂具有良好的保护作用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：本专利技术制备的上清液多组份致病蛋白疫苗与常规的菌体灭活疫苗经安全性性检查、特异性抗体水平及水貂保护率比较无显著差异。本专利技术以铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9的上清液代替菌体，极大解决了血清型差异问题，具有免疫范围广，降低成本，减少免疫接种次数从而减少应急，增加经济收入的效果，并且对水貂具有良好的保护作用。附图说明图1为特异性抗体水平检测结果图示；图2为特异性细胞分泌抗体检测结果图示；图3为ZHDL9强毒株攻毒保护实验结果图示。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。本专利技术制备灭活疫苗所用的铜绿假单胞菌ZHDL9及检验所用的铜绿假单胞菌ZHDL9是通过大连瓦房店水貂养殖区临床分离得到(任何公众均可通过常规手段分离获得)，通过提取测序比对得知。实施例1一种水貂出血性肺炎灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：(1)培养分离鉴定的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9：将分离鉴定的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9接种于LB琼脂培养基，无菌环境下挑选单菌落于液体培养基中，培养至细菌培养液在OD600处的吸光度值为0.62时，再37℃扩大培养12h，然后25℃避光静止培养三天以上直至呈绿色荧光；(2)灭活处理：向铜绿假单胞菌菌液中缓慢加入甲醛灭活，边加入边震荡，使其充分混匀，直至甲醛溶液的终浓度为菌液体积总量的0.4％，置于37°摇床震荡处理，摇床转速160r/min，灭活处理72小时，涂板检验菌液是否彻底灭活；(3)配苗：将灭活检验合格的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9菌液13000rpm离心，取上清液，向上清液中加入饱和硫酸铵溶液，使上清液中的蛋白质沉淀，离心，取沉淀的蛋白质，将沉淀的蛋白质用无菌生理盐水本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水貂出血性肺炎灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：(1)培养分离鉴定的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9：将分离鉴定的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9接种于LB琼脂培养基，无菌环境下挑选单菌落于液体培养基中，培养至细菌培养液在OD600处的吸光度值为0.6～0.8之间，再37℃扩大培养12h，然后25℃避光静止培养三天以上直至呈绿色荧光；(2)灭活处理：向铜绿假单胞菌菌液中缓慢加入甲醛灭活，边加入边震荡，使其充分混匀，直至甲醛溶液的终浓度为菌液体积总量的0.4％，置于37°摇床震荡处理，摇床转速160‑180r/min，灭活处理72小时，涂板检验菌液是否彻底灭活；(3)配苗：将灭活检验合格的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9菌液离心，取上清液，向上清液中加入饱和硫酸铵溶液，使上清液中的蛋白质沉淀，离心，取沉淀的蛋白质，将沉淀的蛋白质用无菌生理盐水溶解，调整多组份蛋白浓度为500ug/ml，加入佐剂，4度过夜，即得。

【技术特征摘要】
1.一种水貂出血性肺炎灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：(1)培养分离鉴定的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9：将分离鉴定的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9接种于LB琼脂培养基，无菌环境下挑选单菌落于液体培养基中，培养至细菌培养液在OD600处的吸光度值为0.6～0.8之间，再37℃扩大培养12h，然后25℃避光静止培养三天以上直至呈绿色荧光；(2)灭活处理：向铜绿假单胞菌菌液中缓慢加入甲醛灭活，边加入边震荡，使其充分混匀，直至甲醛溶液的终浓度为菌液体积总量的0.4％，置于37°摇床震荡处理，摇床转速160-180r/min，灭活处理72小时，涂板检验菌液是否彻底灭活；(3)配苗：将灭活检验合格的铜绿假单胞菌强毒株ZHDL9菌液离心，取上清液，向上清液中加入饱和硫酸铵溶液，使上清液中的蛋白质沉淀，离心，取沉淀的蛋白质，将沉淀的蛋白质用...

【专利技术属性】
技术研发人员：张敏敏，于彦强，刘跃光，李术梅，刘培福，
申请(专利权)人：于彦强，
类型：发明
国别省市：山东;37