荧光假单胞菌铁调控蛋白的应用制造技术

本发明专利技术涉及分子疫苗学领域，具体的说是荧光假单胞菌铁调控蛋白的应用。铁调控蛋白用于制备荧光假单胞菌的免疫疫苗。本发明专利技术的铁调控蛋白作为疫苗能够有效地保护牙鲆抵御荧光假单胞菌侵染。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子疫苗学领域，具体的说是。
技术介绍
荧光假单胞菌是一种革兰氏阴性细菌，广泛分布于各种环境。荧光假单胞菌是重 要的水生动物病原菌，能够感染水生脊椎动物和无脊椎动物，前者包括多种养殖经济鱼类。 对鱼类而言，荧光假单胞菌感染宿主范围广，既包括淡水鱼类也包括海水鱼类。目前对该菌 引起的疾病在国内尚无有效防范措施。铁是一种细菌生存所必需的营养成分。在许多细菌 中的研宄表明，铁调控大量细菌蛋白的表达，这些蛋白参与各种生物功能，包括铁获取和运 输、代谢反应以及致病过程等。在某些细菌中，位于细胞表面的铁调控蛋白参与细菌感染过 程并具有免疫保护作用。目前荧假单胞菌铁调控蛋白的研宄很少，其作用也不甚清楚。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供。 为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为： 一种，铁调控蛋白用于制备荧光假单胞菌的免疫 疫苗。所述铁调控蛋白为质粒PETTfeR或pETOprF。 进一步的说，以荧光假单胞菌TSSl为模板，采用F1/R1或F2/R2为引物分别进行 PCR扩增，PCR产物分别与载体pET259连接，获得质粒pETTfeR或pETOprF，所得质粒分别 转化大肠杆菌BL21(DE3)即可表达重组铁调控蛋白。所述引物为Fl:5' -GATATCATGAGCCCCAGCTTCAACGCCT-3' ；R1 :5'-GATATCCGATGTAG TCACCGACGCGAA-3' ；F2 :5'-GATATCATGAAACTGAAAAACACCTTGG-3' ；R2 :5'-GATATCCTGAGCGGTA GCTTCAACC-3'。 本专利技术具有如下优点： 1.显著保护性。本专利技术的荧光假单胞菌铁调控蛋白作为疫苗对荧光假单胞菌的免 疫保护效率达50%以上。 2.本专利技术的疫苗无需商业化佐剂。【附图说明】 图1为本专利技术实施例提供的纯化的铁调控蛋白（泳道1)。泳道M，分子量标准。【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例旨在对本专利技术进行举例描述，而 非以任何形式对本专利技术进行限制。在本专利技术实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如 下方法： 1?质粒提取、DNA(PCR)产物纯化皆使用"天根生化科技（北京）有限公司"的相 应试剂盒。 2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法（Sambrookand Russell:MolecularCloning:ALaboratoryMannual.ColdSpringHarborLaboratory Press2001)； 3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于"北京，纽英伦生物技术有限公司"。 实施例1 荧光假单胞菌铁调控蛋白TfeR和OprF的表达受铁条件调控 荧光假单胞菌TSSl在正常LB培养基（对照组）或含有600uM铁络合物 2, 2'-dipyridyl(购于美国Sigma公司）的LB培养基中摇动培养2h，培养温度为28°C，转速 160rpm。随后以5000g，4°C离心10min，收集菌体。将收集的菌体进行荧光定量PCR检测TfeR 或OprF基因的表达（具体方法见文献：ZhangSR,ZhangL,SunL.Identificationand analysisofthreevirulence-associatedTonB-dependentoutermembranereceptors ofPseudomonasfluorescens.DisAquatOrg. 2014;110:181-91.)。结果表明，在铁络合 物2, 2' -dipyridyl的存在下，TfeR和OprF基因的表达量显著（P〈0. 01)上调（即检测到 的TfeR和OprF的mRNA量显著增多）（分别为对照组的14倍和30倍），说明这两个基因受 铁条件调控。 所述LB组成成分按重量百分比计：1.0%蛋白胨，0.5 %酵母粉，1.0%氯化 钠，97. 5 %蒸馏水；所述菌株TSSl保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCCNo. 2329,分类命名为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens)保藏日期为2008年1月9日，保藏单位地址为北京市朝阳区大屯路，中国科 学院微生物研宄所。 实施例2 重组荧光假单胞菌铁调控蛋白rTfeR和rOprF的制备 步骤l)rTfeR和rOprF的表达载体pETTfeR和pETOprF的构建： 焚光假单胞菌TfeR和OprF的序列已被报道（GenBankaccessionnumber. AFJ59752. 1和AFJ59305. 1)。pETTfeR的构建如下：以荧光假单胞菌TSSl为模 板，采用引物F1/R1扩增TfeR基因。PCR条件为：94°C60s预变性模板DNA，然后 94°C40s, 60°C60s, 72°C60s, 5 个循环，然后 94°C40s, 66°C60s, 72°C60s, 30 个循环。PCR 产物用天根的相应试剂盒纯化。将表达载体pET259(pET259构建过程参见HuYH，Zheng ffff,SunL.Identificationandmolecularanalysisofaferritinsubunitfromred drum(Sciaenopsocellatus) ?FishShellfishImmunol2010 ;28:678_86)用限制性内切 酶SwaI酶切后与上述纯化的PCR产物用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5a， 在含卡那霉素（50ug/ml)的LB培养基上培养18 - 24小时，筛选转化子提取质粒，即为 pETTfeR。pETOprF的构建如下：以荧光假单胞菌TSSl为模板，采用引物F2/R2PCR扩增OprF 基因。PCR条件为：94°C60s预变性模板DNA，然后94°C40s，56°C60s，72°C60s，5个循环， 然后94°C40s，62°C60s，72°C60s，30个循环。PCR产物用天根的相应试剂盒纯化。将表达 载体PET259用限制性内切酶SwaI酶切后与上述纯化的PCR产物用T4DNA连接酶连接，连 接液转化入大肠杆菌DH5a，在含卡那霉素（50ug/ml)的LB培养基上培养18 - 24小时， 筛选转化子提取质粒，即为pETOprF。 所述引物为Fl:5' -GATATCATGAGCCCCAGCTTCAACGCCT-3' ；R1 :5'-GATATCCGATGTAG TCACCGACGCGAA-3' ；F2 :5'-GATATCATGAAACTGAAAAACACCTTGG-3' ；R2 :5'-GATATCCTGAGCGGTA GCTTCAACC-3'。 步骤2)重组荧光假单胞菌铁调控蛋白rTfeR和rOprF的诱导表达和纯化： rTfeR的诱导表达和纯化如下：将上述步骤1)质粒pETTfeR用常规方法转化大肠 杆菌BL21(DE3)(购自于"天根生化科技有限公司"，北京），在含有卡那霉素（50ug/ml)的 LB固体培养基上培养18 - 24小时，挑取转化子，将其命名为BL21/pETTfeR。将BL21/ pETTfeR于含有卡那霉素本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荧光假单胞菌铁调控蛋白的应用，其特征在于：铁调控蛋白用于制备荧光假单胞菌的免疫疫苗。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙黎，孙园园，刘莉，迟恒，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37