一种表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒传染性克隆的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒传染性克隆的构建方法，是将特定PCR引物扩增出的绿色荧光EGFP基因片段，插入到线性化的REV病毒基因组Env基因的N端，利用商品化的重组酶ExnaseTM II不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆，随后转化到大肠杆菌进行质粒扩增与鉴定；并将阳性克隆转染DF1细胞，拯救获得表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒传染性克隆的构建方法。此专利技术不仅可获得表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV示踪病毒，填补了国内外空白；为研究REV病毒在机体内复制，组织嗜性及其致病机理提供了材料；同时为开发REV作为病毒载体表达外源基因提供了可能。
技术介绍
禽网状内皮组织增生症病毒(REV)主要引起以网状内皮细胞增生为主要特征的一组综合征，包括急性网状细胞增生症、矮小综合征和淋巴组织及其它组织的慢性肿瘤增生性疾病。REV感染鸡群往往生长迟缓，淘汰率和死亡率升高；并引起感染鸡的免疫抑制，干扰其它禽病疫苗的免疫效应，导致免疫失败。该病目前已呈世界范围流行，但对其细胞感染受体、病毒复制位点及其致病机理等方面知之甚少。构建表达绿色荧光蛋白的示踪病毒已被广泛应用于病毒受体、组织嗜性及其致病机理等研究中。国内外学者也尝试将绿色荧光蛋白基因插入REV基因组，拯救表达绿色荧光蛋白的REV示踪病毒，但由于选择的插入位点的不适宜目前尚未成功获得表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒。本研究将绿色荧光EGFP基因，利用商品化的重组酶ExnaseTMII，插入到REV病毒基因组合适的插入位点，构建并成功拯救出了表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于构建表达绿色荧光囊膜蛋白的REV病毒传染性克隆，并拯救出相应病毒。本专利技术的原理和最核心的关键技术是科学地设计引物扩增出含REV传染性线性化载体以及EGFP基因片段，利用商品化的重组酶ExnaseTMII不经酶切连接反应，将EGFP基因片段插入到REV传染性克隆env基因的N端，在体外快速重组克隆，并将阳性克隆转染DF1细胞拯救出表达绿色荧光囊膜蛋白的REV病毒。所述引物如下：a，PCR扩增出REV传染性克隆SNV线性化载体；上游引物：5′CTAATTCTCCTTGTGGCTTGGTGGGGGTTT3′(SEQIDNO.1)；下游引物：5′GATTTTGCTCGCCTGGTCAACTTTACCCTC3′(SEQIDNO.2)。b，PCR扩增出绿色荧光蛋白基因EGFP；上游引物：5′CAGGCGAGCAAAATCATGGTGAGCAAGGGCGAG3′(SEQIDNO.3)；下游引物：5′CACAAGGAGAATTAGCTTGTACAGCTCGTCCAT3′(SEQIDNO.4)。本专利技术公开了PCR扩增REV传染性克隆SNV线性化载体以及PCR扩增EGFP基因，用于构建表达绿色荧光囊膜蛋白的REV传染性克隆的引物序列。本专利技术还公开了一种基于REV病毒LTR的外源基因快速构建表达绿色荧光囊膜蛋白的REV传染性克隆的方法，是用重组酶ExnaseTMII，将线性化的REV传染性克隆载体与EGFP基因片段PCR产物不经酶切连接反应，直接重组克隆获得表达绿色荧光囊膜蛋白的REV传染性克隆。本专利技术一种表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒传染性克隆的构建方法，包括以下步骤：1)利用序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的引物，以REV传染性克隆质粒SNV质粒为模板，PCR扩增出SNV线性化载体；2)利用序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4引物，以pcDNA3.1-EGFP质粒为模板，PCR扩增出绿色荧光蛋白基因EGFP；3)利用重组酶ExnaseTMII对步骤1)和2)得到的PCR产物进行快速重组克隆；阳性克隆转染DF1细胞拯救出表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒。本专利技术表达绿色荧光囊膜蛋白的REV传染性克隆的构建及病毒拯救；分别以含REV病毒前病毒全基因组质粒SNV以及含EGFP基因质粒为模版，PCR分别扩增出REV传染性克隆线性化载体以及EGFP基因片段(附图1，步骤1)；并利用重组酶ExnaseTMII进行快速重组克隆(附图1，步骤2)；阳性克隆即可进行DF1细胞转染、拯救病毒(附图1，步骤3)。利用本专利技术设计的引物，通过重组酶ExnaseTMII可以快速获得含有EGFP基因片段的REV传染性克隆质粒。该克隆方法不依赖于限制性内切酶以及连接酶，大大简化了含EGFP基因片段的REV传染性克隆的构建过程，提高了效率。获得的含EGFP基因片段的REV传染性克隆转染DF1细胞，即可获得表达绿色荧光囊膜蛋白的REV病毒。获得表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV示踪病毒，填补了国内外空白；为研究REV病毒在机体内复制，组织嗜性及其致病机理提供了材料；同时为开发REV作为病毒载体表达外源基因提供可能。附图说明图1表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV传染性克隆构建及病毒拯救策略步骤1：以含REV病毒前病毒全基因组质粒SNV以及含EGFP基因的pcDNA3.1-EGFP为模版，利用表1中相应引物，PCR分别扩增出线性化REV传染性克隆载体以及EGFP基因片段；步骤2：利用重组酶ExnaseTMII进行快速重组克隆；步骤3：阳性克隆转染DF1细胞拯救病毒。图2PCR扩增线性化REV载体和EGFP片段泳道1，1kbMarker；泳道2，扩增出的线性化REV传染性克隆载体；泳道3，扩增出的EGFP片段。图3PCR鉴定含EGFP的REV传染性克隆泳道1-6，PCR扩增REV载体片段；泳道M，1kbMarker；泳道7-12，PCR扩增EGFP片段。图4表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒拯救效果A，转染含EGFP的REV传染性克隆5天后的荧光；B，第一代传代细胞观察到的荧光；C，第三代传代细胞观察到的荧光；D，第五代传代细胞观察到的荧光。具体实施方式为更好的理解本专利技术的内容，以下实施方式结合附图展示表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV传染性克隆的构建及其病毒拯救。实施例：1)设计扩增REV传染性克隆线性化载体以及EGFP基因片段引物：扩增REV传染性克隆线性化载体上游引物位于SNV毒株前病毒基因组6112-6141位；扩增含REV病毒LTR的线性化载体下游引物位于SNV毒株前病毒基因组6082-6111位；扩增EGFP基因的上游引物中除了自EGFP基因ATG起始的18个EGFP基因特异的碱基外，在其5端还带有15个与扩增REV传染性克隆线性化载体下游引物反向互补的碱基；扩增EGFP基因的下游引物中除了EGFP基因3末端特异的18个碱基外，带有15个保守的与扩增含REV传染性克隆线性化载体上游引物互补的碱基。具体引物序列见附表1，由LifeTechnologi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒传染性克隆的构建方法，其特征在于包括以下步骤：1)利用下述引物，以REV传染性克隆质粒SNV质粒为模板，PCR扩增出SNV线性化载体；上游引物：5′CTAATTCTCCTTGTGGCTTGGTGGGGGTTT3′；下游引物：5′GATTTTGCTCGCCTGGTCAACTTTACCCTC3′。2)利用下述引物，以pcDNA3.1‑EGFP质粒为模板，PCR扩增出绿色荧光蛋白基因EGFP；上游引物：5′CAGGCGAGCAAAATCATGGTGAGCAAGGGCGAG3′；下游引物：5′CACAAGGAGAATTAGCTTGTACAGCTCGTCCAT3′。3)利用重组酶ExnaseTM II对步骤1)和2)得到的PCR产物进行快速重组克隆；阳性克隆转染DF1细胞拯救出表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒。

【技术特征摘要】
1.一种表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒传染性克隆的构建方法，其
特征在于包括以下步骤：
1)利用下述引物，以REV传染性克隆质粒SNV质粒为模板，PCR扩增
出SNV线性化载体；
上游引物：5′CTAATTCTCCTTGTGGCTTGGTGGGGGTTT3′；
下游引物：5′GATTTTGCTCGCCTGGTCAACTTTACCCTC3′。
2)利用下述引物，以pcDNA3.1-E...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶建强，周晓祥，秦爱建，邵红霞，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32