本发明专利技术涉及一种组装TALE/TALEN模块的方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术采用一次PCR来获得组装TALE模块，具体技术方案包括：首先设计4 gBlock DNA寡核苷酸，在相邻2个寡核苷酸之间有30bp的重叠；然后通过PCR将它们连接起来，再克隆为一个表达载体；为了检测这一合成物的作用，我们设计一个携带p53结合位点和mCherry荧光蛋白的报告基因，检测p53特异性TALE是否能活化报告载体及内源性lncRNA-RoR启动子，证明了实验的准确性；本发明专利技术与传统组装DNA连接模块的方法相比，更为方便、简单，省时省力，经济高效。
【技术实现步骤摘要】
一种组装TALE/TALEN模块的方法
本专利技术涉及一种组装TALE/TALEN模块的方法，属于基因工程
技术介绍
对复杂的基因组进行定点修饰，探讨基因功能，在基因工程中越来越重要。人工核酸内切酶（ENN）是能将特定的DNA结合蛋白跟特定的核酸内切酶相互融合构建而成的一种人造蛋白，它目前主要包括3种类型：锌指核酸酶（Zinc-fingernuclease,ZFN）、类转录激活因子效应物核酸酶（Transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN），以及人工的大范围核酸酶（Meganuclease）。转录激活因子效应物核酸酶（Transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN）是基因工程的新工具。类转录激活因子效应物TALE来自一类特殊的植物病原体——黄单胞杆菌（Xanthomonasspp）。由于FokI核酸内切酶一二聚体形式发挥功能，TALENs都是成对的绑定和切割DNA序列。TALENs能与DNA序列特异性结合主要由TAL效应物上的多肽氨基酸的可变序列。类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）是将一种能够产生基因敲除的核酸酶融合到TALE的DNA连接部位。它被认为是一种新的、核酸靶序列与蛋白质的锌指基序（motif）之间对应性更强、便于预测的DNA结合结构域。目前，构建识别特定DNA序列的TALE/TALEN就成为这一技术中的一个关键步骤和应用中的主要瓶颈。除了可以选择全序列人工合成这一昂贵的方法之外，通过分子克隆的途径人工构建TALE的方法主要包括四大类：(1)基于GoldenGate（GG）克隆的方法：根据单体的不同来源可分为基于PCR的GG法(GG-PCR)和传统的基于质粒载体的GG法（GG-Vector）。(2)基于连续克隆组装的方法：包括限制性酶切－连接法（Restrictionenzymeandligation,REAL）、单元组装法（Unitassembly,UA）和idTALE一步酶切次序连接法。(3)基于固相合成的高通量方法：包括FLASH和ICA（Iterativecappedassembly）。(4)基于长粘末端的LIC（Ligation-independentcloning）组装方法等。GoldenGate法把IIS类限制性内切酶的识别位点分别反向放置在一段DNA片段的5’和3’端，酶切反应后，识别位点被切除，并在5’和3’留下粘性末端。如果两段DNA序列具有互补的粘性末端，就可以通过连接反应连接在一起。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种方便快捷的方法组装TALE模块，在基础理论研究、临床治疗等领域建立广阔的应用前景。本专利技术采用一次PCR来获得组装TALE模块，本专利技术使用来自lncRNA-RoR启动子p53结合区域（TGACTTGCATGTACATGCCC）来证明这一方法的准确性。具体实施步骤如下：（1）首先设计4gBlockDNA寡核苷酸，如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示；所述4gBlockDNA寡核苷酸序列在在相邻2个寡核苷酸之间有30bp的重叠。（2）通过一次PCR将它们连接在一起，形成TALE模块，然后克隆到pTAL1-pCDH载体上；A.制备pTAL1-pCDH载体，所述pTAL1-pCDH载体包含BsmB1酶切位点，序列如SEQIDNO.5所示；B.PCR一步法组装TALE模块，也就是将步骤（1）中所述的4gBlockDNA寡核苷酸，克隆到带有BsmB1酶切位点的pTAL1-pCDH表达载体上。所述组装TALE/TALEN模块的验证方法如下：（1）设计一个携带p53结合位点和mCherry荧光蛋白的TALE报告基因，序列如SEQIDNO.6所示；（2）PCR扩增4gBlocks中lncRNA-RoR启动子p53结合区域（RoR-p53RE）部分（TGACTTGCATGTACATGCCC）；（3）TALE报告基因与未组装TALE模块的pTAL1-pCDH载体即空载体，或者与携带gBlock-RoR-p53RE的pTAL1-pCDH共转染至293Tcells，验证结果。其中步骤（3）中所述的共转染方法为：（1）将293T细胞种到12孔板，每孔铺满40%；（2）第二天，每孔通过标准方法转染1µg质粒；（3）第三天，使用荧光显微镜观察情况。本专利技术的创新之处在于，采用一次gBlock-PCR和克隆法来组装TALE模块，将会具有以下有益效果：（1）准确性高，更加方便快捷。GoldenGate方法通过II型限制性核酸内切酶，剪切识别位点部位，建立独立的4bp悬突（粘性末端）。直接合成法最大的缺陷在于价格昂贵，并且合成大于1000bp的DNA的成功率和准确率很低。基于GoldenGate的方法在最初需要比较复杂的PCR引物和DNA片段设计，以便得到合适的粘性末端序列，从而将重复序列依次顺序连接。在实验过程中需要构建大量的载体或使用很多引物，有时还需要PCR扩增。而且，GoldenGate的方法是一步法进行酶切和连接，条件控制严格而复杂，需要较长的摸索和调整，效率和成功率有待更多的实践和时间检验。（2）省时，经济，大大节约成本。GoldenGate法费时又费力，具有技术挑战性，需要包括植入细菌、连接转化等步骤来完成总实验时间长达十余天。而本专利技术通过一次PCR组装仅需4天，节约大量时间和成本。为了检测本专利技术合成物的作用，我们设计一个荧光蛋白的报告基因。通过实验来检测，结果也是准确的。（3）在实际的应用中，gBlock-PCR克隆法能够更好地替代传统的Golden-gate法。不需要大量的引物构建基本重复单元，无需复杂的实验方法和特殊的连接酶，所有使用的酶均为常规的限制性内切酶，实验操作也很简便，无需特殊的条件。每一个有条件从事基本分子生物学实验的实验室均可以操作。因此，这将在基因工程（如基因活化、基因敲除及敲入）发展中具有巨大潜力。附图说明图1为Golden-gate对RoR-p53RE连接方法。图2为本专利技术中gBlock-PCR克隆法。图3为传统Golden-gate与本专利技术中克隆方法的比较。图4为将RoR-p53RE克隆到pTAL1-pCDH的BasmB1部分。图5为PCR组装的TALE模块克隆到BsmB1酶切位点的pTAL1-pCDH表达载体上，并连接携带mCherry信号的TALE报告基因。图6为验证RoR-p53RETALE结果图。具体实例方式以下结合实施例对本专利技术做进一步说明，实施例是用于说明本专利技术而不是用于限制本专利技术的范围。实施例1：1.试验方法：（1）从IDT公司获得4gBlockDNA片段序列，通过一次PCR将它们连接在一起，然后克隆到pTAL1-pCDH载体上。每一个模块，例如NG，NN，NI和HD，由34个氨基酸（或者102bp）组成，分别特异性绑定在T，G，A和C碱基上。（2）PCR组装的TALE模块克隆到pTAL1-pCDH表达载体的BsmB1区域上，用抑制降解和DNA序列测序来证实。A.PCR扩增4gBlocks中RoR-p53RE部分，反应条件为：B.准备含BsmB1的pTAL1-pC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种组装TALE/TALEN模块的方法，其特征在于，按照以下步骤操作：（1）首先设计4 gBlock DNA寡核苷酸，如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；（2）通过一次PCR将它们连接在一起，形成TALE模块，然后克隆到pTAL1‑pCDH载体上；A. 制备pTAL1‑pCDH载体，序列如SEQ ID NO.5所示；B. PCR一步法组装TALE模块，也就是将步骤（1）中所述的4 gBlock DNA寡核苷酸，克隆到带有BsmB1酶切位点的pTAL1‑pCDH表达载体上。
【技术特征摘要】
1.一种组装TALE/TALEN模块的方法，其特征在于，按照以下步骤操作：（1）首先设计4gBlockDNA寡核苷酸，如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示；（2）通过一次重叠PCR将步骤（1）中的4gBlockDNA寡核苷酸按照SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4的顺序连接在一起，形成TALE模块，然后克隆到pTAL1-pCDH载体上；A.制备pTAL1-pCDH载体，序列如SEQIDNO.5所示；B.一次重叠PCR法组装TALE模块，也就是将4gBlockDNA寡核苷酸组装的TALE模块克隆到pTAL1-pCDH表达载体的BsmB1酶切位点；所述4gBlockDNA寡核苷酸序列在相邻2个寡核苷酸之间有30bp的重叠；所述组装TALE模块通过携带p53结合位点和mCherry荧光蛋白的TALE报告基因验证准确性；所述验证方法如下：（1）设计一个携带p53结合位点和mCherry荧光蛋白的TALE报告基因，序列如SEQIDNO.6所示；（2）...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐岷，龚爱华，蔡菁，张尤历，莫寅元，
申请(专利权)人：江苏大学附属医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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