一种膜蛋白MscL融合载体及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种膜蛋白MscL融合载体及其构建方法。本发明专利技术利用水母绿色荧光蛋白GFP作为C端两亲性标签，利用C端His作为纯化和检测标签，将GFP蛋白和MscL蛋白的基因片段嵌入pET‑28a质粒中，构建了pET28a‑MscL‑GFP‑His重组载体。本发明专利技术构建的融合载体实现了膜蛋白MscL的可视化表达，同时与常规菌株相比，转化了融合载体的菌MscL膜蛋白的表达稳定性和产量均显著提高，为实验研究和工业生产免去了繁琐的验证环节，提高效率，节省开支。

【技术实现步骤摘要】
一种膜蛋白MscL融合载体及其构建方法
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种膜蛋白MscL融合载体及其构建方法。
技术介绍
生物膜离子通道是各种无机离子跨膜被动运输的通路。离子通道的开放和关闭，称为门控，根据门控机制的不同，离子通道分为电压门控性，配体门控性，和机械门控性。机械门控性，即机械敏感性离子通道(Mechanosensitive，MS)是指一类感受细胞膜表面应力变化，实现胞外机械信号向胞内转导的通道，根据通透性分为离子选择性和非离子选择性通道，根据功能作用分为张力激活型和张力失活型离子通道。当活细胞和有机体受到环境中的机械刺激时，机械信号随即转化成生物信号，使细胞作出反应，此过程被称为机械转导。生物体对机械刺激产生反应和适应的能力在许多生理现象中表现重要作用，例如听觉和平衡的产生、体液平衡和血压、多精受精的防止、细胞体积和形状调控、细胞移动、组织生长和形态发生等。机械刺激包括高频震动、渗透压的变化、静水压和液体的剪切力等。机械信号的转导有多种途经，每种途径都能筛选出相关的刺激和过滤掉无关的刺激。在机械信号转导过程中，机械敏感性离子通道(mechanosensitivechannel)起了很重要作用。根据导电能力的大小，机械敏感性离子通道又分为两种：一是高导电机械敏感性离子通道(Themechanosensitivechanneloflargeconductance，MscL)，二是低导电械敏感性离子通道(Themechanosensitivechannelofsmallconductance，MscS)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种膜蛋白MscL融合载体，所述融合载体中的膜蛋白MscL的表达量及其稳定性显著提高，同时载体中嵌入了GFP蛋白的基因片段，实现了膜蛋白MscL的可视化表达。实现上述目的的技术方案如下：一种膜蛋白MscL融合载体，为依次将MscL蛋白和GFP蛋白的基因片段嵌入pET-28a质粒中形成的全长序列为SEQNO.7的融合载体。进一步地，本专利技术还提供上述膜蛋白MscL融合载体的构建方法，具体步骤如下：步骤1，构建机械敏感通道蛋白MscL融合载体：PCR扩增得到上游含有NdeI限制性核酸内切酶位点，下游含有HindⅢ限制性核酸内切酶位点的机械敏感通道蛋白MscL的cDNA，双酶切MscL的cDNA和pET28a载体，连接反应得到pET28a-MscL-His载体。步骤2，构建水母绿色荧光蛋白GFP融合载体：PCR扩增得到上游含有HindⅢ限制性核酸内切酶位点，下游含有NotⅠ限制性核酸内切酶位点的绿色荧光蛋白GFP的cDNA，双酶切GFP的cDNA和pET28a-MscL-His载体质粒，连接反应得到pET28a-MscL-GFP-His载体；本专利技术与现有技术相比，具有以下显著效果：(1)本专利技术的膜蛋白MscL融合载体能够表达水母绿色荧光蛋白GFP，表达目的蛋白的菌体和常规菌体在颜色上有明显差异，能够实现可视化表达，可以直观看到膜蛋白MscL是否正确表达，简化后续的验证；(2)与常规表达相比，膜蛋白MscL的产量有明显提高，产量提高了近20倍，为后续研究提供了充足的样品；(3)与常规表达相比，表达得到的膜蛋白MscL的稳定性显著增强。附图说明图1为MscLPCR琼脂糖凝胶电泳结果。图2为pET28a-MscL-His质粒图谱。图3为GFPPCR琼脂糖凝胶电泳结果。图4为pET28a-MscL-GFP-His质粒图谱。图5为anti-HisWesternBlot验证实验结果图。图6为融合表达MscL-GFP菌体(a)和常规菌体(b)。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步详述。本专利技术实施例中的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识。实施例中所用材料如下：1.细胞来源大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)细胞购自武汉灵淼生物公司。2.表达载体来源pET28a购自MERK公司3.引物来源合成引物均来自上海生工生物有限公司4.主要试剂胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、Tris-baes均购自Sigma公司；限制性核酸内切酶购自ThermoFisher公司；rTaq酶、T4连接酶购自Takara公司。质粒小提试剂盒、凝胶回收试剂盒购自Axygen公司。兔源Anti-HismAb购自CST公司，兔抗HRP标记二抗购自Jackson公司；显影液及定影液购自Tanon公司。实施例1构建机械敏感通道蛋白MscL融合载体：(1)下游检索NCBI数据库得到大肠杆菌机械敏感通道蛋白MscL的基因序列，根据基因序列设计1对引物。上游引物的寡核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，下游引物的寡核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。根据pET28a质粒的多克隆位点特点，在MscL上游设计引入NdeI限制性核酸内切酶位点，下游设计引入HindⅢ限制性核酸内切酶位点。以大肠杆菌基因组DNA为模板，经过聚合酶链式反应得到MscL的cDNA。(2)回收MscL的cDNA，用NdeⅠ和HindⅢ双酶切回收产物和pET28a质粒，后进行琼脂糖凝胶电泳，回收酶切产物；将回收的MscL的cDNA和pET28a质粒线性片段，按浓度比为3:1比例加入小离心管中，加入T4连接酶，在22℃下连接2h。(3)以上连接产物取20μL用42℃热激法转化入100μLDH5α感受态细胞，加入700μLLB培养基后置于37℃摇床，在200转/分钟下培养45分钟。(4)上述菌液在4000转/分钟转速下离心1分钟后，吸去700μL上清；用移液器轻轻吹吸剩余培养基后涂布在含有卡那霉素的LB固体平板上，倒置于37℃培养箱中，培养12小时。(5)挑取上述平板中的单菌落，小量扩增后提取质粒，用NdeⅠ和HindⅢ单酶切双酶切所提取质粒后经琼脂糖凝胶电泳鉴定，经测序鉴定正确后，得到pET28a-MscL-His载体如图2所示。酶切验证结果如图1所示。实施例2构建水母绿色荧光蛋白融合载体：(1)构建水母绿色荧光蛋白GFP融合载体：根据上步得到的pET28a-MscL-His载体，设计引物。上游引物的寡核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，下游引物的寡核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。根据pET28a-MscL-His载体的多克隆位点特点，在GFP片段的上游设计引入HindⅢ限制性核酸内切酶位点，下游设计引入NotⅠ限制性核酸内切酶位点。在GFP末端无终止子的情况下，可引入pET28a本身所带的His标签。经过聚合酶链式反应(PCR)，得到GFP的cDNA。(2)回收水母绿色荧光蛋白GFP的cDNA，用HindⅢ和NotⅠ双酶切回收产物和pET28a-MscL-His载体，后进行琼脂糖凝胶电泳，回收酶切产物；将回收的GFP的cDNA和pET28a-MscL-His载体线性片段，按浓度比为3:1比例加入小离心管中，加入T4连接酶，在22℃下连接2h。(3)以上连接产物取20μL用42℃热激法转化入100μLDH5α感受态细胞，加入700μLLB培养基后置于37℃摇床，在200转/分钟下培养45分钟。(4)上述菌液在4000转/分钟转速下离心1分钟后，吸去700μL上清；用移液器轻轻吹吸剩余本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种膜蛋白MscL融合载体，其特征在于，为将GFP蛋白和MscL蛋白的基因片段嵌入pET‑28a质粒中形成的全长序列为SEQ NO.7的融合载体。

【技术特征摘要】
1.一种膜蛋白MscL融合载体，其特征在于，为将GFP蛋白和MscL蛋白的基因片段嵌入pET-28a质粒中形成的全长序列为SEQNO.7的融合载体。2.根据权利要求1所述的膜蛋白MscL融合载体的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤1，构建机械敏感通道蛋白MscL融合载体：PCR扩增得到上游含有NdeI限制性核酸内切酶位点，下游含有HindⅢ限制性核酸内切酶位点的机械敏感通道蛋白Ms...

【专利技术属性】
技术研发人员：周敏，魏京楠，卢颖洪，
申请(专利权)人：南京理工大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32