高效产氢功能基因载体pET32a‑fdhF及其构建和应用制造技术

高效产氢功能基因载体pET32a‑fdhF及其构建和应用涉及基因工程技术领域。pET32a‑fdhF基因载体为包含有蜡状芽孢杆菌甲酸脱氢酶fdhF基因的pET32a质粒。其构建是通过设计引物扩增蜡状芽孢杆菌中甲酸脱氢酶fdhF基因片段，并用重组酶将其连接到含有对应连接末端的pET32a片段中，进行基因测序，验证基因的完整性。将pET32a‑fdhF质粒转化到细菌中，在产氢培养基中培养此细菌生产氢气。pET32a‑fdhF能够应用于不同细菌中，既能使不产氢的细菌产氢，也能使产氢的细菌的产氢效率明显提高，消耗同样的底物浓度能产生更快更多的氢气。也能够改良现有工业产氢的大肠杆菌。

【技术实现步骤摘要】
高效产氢功能基因载体pET32a-fdhF及其构建和应用
本专利技术涉及基因工程
，特别涉及一种高效产氢功能基因载体pET32a-fdhF及其构建和应用。
技术介绍
随着煤炭、石油等化石能源的储备不断枯竭，急需发展新型能源，而氢能做为清洁且高热能的能源而备受关注。氢能源虽可通过化学方法得到，但因其成本高且可能造成的环境污染问题而受到争议，而生物产氢则能解决这个问题。生物产氢的微生物有很多，其中大肠杆菌产氢无论从成本还是从效率来看都是最佳选择之一。目前来看，野生的大肠杆菌不产氢或者产氢较少，无法满足人类对能源的需求，因此，基因工程或者代谢工程方法就被用来改造大肠杆菌使其产氢性能大量增加。现有的产氢大肠杆菌消耗底物多，但是产生的氢气比较少，效率还比较低，急需通过改造引入外源基因使其产氢效率大幅度提高，而不同的外源基因的产氢效率也有所差别。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一个高效产氢功能基因载体pET32-fdhF，及其构建方法。其能够应用于大肠杆菌BL21中，也能使产氢的细菌的产氢效率明显提高。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术提供一种高效产氢功能基因载体pET32a-fdhF，其为包含有蜡状芽孢杆菌的甲酸脱氢酶基因fdhF的pET32a-fdhF质粒。(说明：将蜡状芽孢杆菌中甲酸脱氢酶基因fdhF进行克隆用于提高产氢量为本专利技术首创，选用pET32a为载体与甲酸脱氢酶基因fdhF进行重组也为本专利技术的创新)本专利技术还提供了高效产氢功能基因载体pET32a-fdhF的构建方法，主要通过使用clonesmartertechnologyTM试剂盒SeamlessAssemblyCloningKit完成重组反应，其原理如下式子所示：(说明：选用SeamlessAssemblyCloningKit试剂盒的方法将载体pET32a与甲酸脱氢酶基因fdhF进行重组构建新的质粒的方法也为本专利技术的创新，该方法不同于以往采用T4连接酶连接基因片段与载体，可以避免在基因片段中间如果含有酶切位点则会被从中间切断的风险。而且此方法操作简便，省去双酶切、连接等步骤，简化了操作过程。例如，在本例中，外源基因连接到pET32a载体的位点选择的是NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，而克隆的fdhF基因内部也有NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，如果用传统的酶切、连接方法，无法将完整的fdhF基因克隆到载体上。)具体操作过程包括以下步骤：(1)线性化载体制备：使用pET32a为载体，使用双酶切方法获得线性化载体。根据pET32a上的酶切点设计引物，PCR扩增fdhF基因片段，其中，作为优选，所述甲酸脱氢酶基因的酶切位点为NdeI，XhoI。(2)DNA片段制备：设计蜡状芽孢杆菌中甲酸脱氢酶基因fdhF的引物，并扩增甲酸脱氢酶基因fdhF。(3)重组反应：通过加入重组酶，将准备好的线性化载体和fdhF基因片段连接起来，得到重组载体。(4)转化：将构建好的重组载体转入感受态大肠杆菌DH5α中。(5)阳性重组子的鉴定：挑取克隆菌，采用载体克隆位点两端的引物做为菌落PCR反应的扩增引物，进行菌落PCR反应，通过电泳进行鉴定，确定重组子后，再提取质粒、测序。本专利技术还提供高效产氢功能基因载体pET32a-fdhF的应用：将pET32a-fdhF质粒转化到大肠杆菌BL21中，在产氢培养基中培养此大肠杆菌生产氢气。本专利技术中使用的蜡状芽孢杆菌，从普如汀生物技术北京有限公司购入。购入后进过鉴定，和蜡状芽孢杆菌Q1株最为接近。本专利技术的有益效果是pET32a-fdhF能够应用于大肠杆菌中，能使产氢的细菌的产氢效率明显提高，消耗同样的底物浓度能产生更快更多的氢气。能够改良现有工业产氢的大肠杆菌。附图说明下面结合附图对本专利技术作进一步说明：图1是载体pET32a-fdhF的构建方案示意图及其western-blot电泳图；a.构建重组质粒pET32a-fdhF-Hisb.Westernblot结果图2是pET32a-fdhF质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中随时间的产氢曲线。具体实施方式下面将结合本专利技术中的实施例和附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1：(1)在NCBI上查找关于蜡状芽胞杆菌甲酸脱氢酶的同源基因序列，再结合pET32a质粒序列，利用DNAMAN软件，设计出带有载体同源序列的甲酸脱氢酶基因的引物。将设计好的引物交给生工生物工程(上海)股份有限公司进行引物合成。设计出来的引物为：Forward-Primer：AACTTTAAGAAGGAGATATACATatggcagaacagacagtccgtgtReverse-Primer：CAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGTCCACAAGTGATACGTATTGT(2)根据设计好的引物，利用PCR技术扩增fdhF基因片段。PCR条件设置：变性95℃30s，复性58℃30s，延伸72℃3分钟，30个循环；50uL体系：25uL2*HiFi-PCRMaster，22uLddH2O，1uLDAN模板，2uL上游引物(10umol/L)，2uL下游引物(10umol/L)。(即用PCR扩增试剂盒，上海生工)(3)将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离，并在凝胶成像仪下切割回收基因片段，最后将切割片段用胶回收试剂盒(OmegaBio-Tek,USA)回收，为35uL基因片段。(4)将胶回收的片段送往基因测序公司测序，以验证扩增基因的正确性。(5)使用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ双酶切pET32a载体。琼脂糖凝胶电泳分离，并在凝胶成像仪下切割载体的大片段(约5400bp)，用胶回收试剂盒回收，获得线性化载体约30uL。(6)从步骤(5)获得线性化的pET32a载体，步骤(3)获得fdhF基因，经重组反应得到含有fdhF基因片段的pET32a质粒10uL：①重组反应(SeamlessAssemblyCloningKit,clonesmartertechnologyTM)：1uLpET32aVector，3uLfdhF基因片段，1uLddH2O,5uLSeamlessMasterMix；②50℃反应15分钟；③转化：将连接好的质粒取5uL加入100uL的DH5α感受态中，冰中放置30分钟；④42℃水浴30秒，再在冰中放置2分钟；⑤加入400uLLB培养基(不含抗生素)，37℃200rpm振荡培养60分钟；⑥将培养液200uL倒入含有氨苄的固体LB培养基37℃培养过夜；挑选单菌落放入100mL含有氨苄的液体LB培养基扩大培养，最后用质粒提取试剂盒(OmegaBio-Tek,USA)提取质粒。(7)阳性重组子的鉴定(菌落PCR法)：；①挑取大小中等的克隆菌至10uL无菌水中，充分混合，取2uL混合液作为PCR反应的模板：②使用载体克隆位点两端的引物做为鉴定重组子的扩增引物③PCR反应条件：变性94℃30s，复性58℃30s，延伸72℃3分钟，30个循环；④取10uLPCR产物电泳鉴定；⑤本文档来自技高网...

【技术保护点】
高效产氢功能基因载体pET32a‑fdhF，其特征在于，所述基因载体为包含有蜡状芽孢杆菌甲酸脱氢酶fdhF基因的pET32a质粒。

【技术特征摘要】
1.高效产氢功能基因载体pET32a-fdhF，其特征在于，所述基因载体为包含有蜡状芽孢杆菌甲酸脱氢酶fdhF基因的pET32a质粒。2.根据权利要求1所述的高效产氢功能基因载体pET32a-fdhF，其特征在于所述蜡状芽孢杆菌为蜡状芽孢杆菌Q1株。3.构建如权利要求1或2所述的高效产氢功能基因载体pET32a-fdhF的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)设计蜡状芽孢杆菌甲酸脱氢酶fdhF基因的引物，并扩增蜡状芽孢杆菌甲酸脱氢酶fdhF基因；(2)回收甲酸脱氢酶fdhF基...

【专利技术属性】
技术研发人员：王海燕，程水源，刘伟，赵雅琪，徐岚婷，王冕超，
申请(专利权)人：北京工业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11