产适冷α‑淀粉酶菌株、构建方法和生产α‑淀粉酶的方法技术

本发明专利技术涉及微生物学、酶工程、发酵工程、食品工程及畜牧养殖等领域，具体涉及一种产适冷α‑淀粉酶菌株、构建方法和生产α‑淀粉酶的方法，包括如下步骤：取海泥提取建立宏基因组；通过筛选获得α‑淀粉酶基因，扩增α‑淀粉酶基因，并插入pET‑20b载体中并转化大肠杆菌表达和生产α‑淀粉酶。本发明专利技术所构建的适冷α‑淀粉酶菌株酶高产菌株，与当前工业用酶的细菌菌株相比，发酵产酶周期短，酶活力高，产酶温度低，因此该菌适用于大规模的发酵生产的特点；具有更高的催化能力；体现了较好的pH稳定性；最适反应温度为15‑20℃；有耐Na

【技术实现步骤摘要】
产适冷α-淀粉酶菌株、构建方法和生产α-淀粉酶的方法
本专利技术涉及微生物学、酶工程、发酵工程、食品工程及畜牧养殖等领域，具体涉及一种产适冷α-淀粉酶菌株、构建方法和生产α-淀粉酶的方法。本专利技术生产的α-淀粉酶主要应用于食品加工、饲料添加剂及纺织等行业。
技术介绍
α-淀粉酶又称液化酶(1,4-α-D一葡萄糖苷水解酶，EC3.2.1.1)以淀粉为底物，水解淀粉内部1,4-α-D-葡萄糖苷键，致使糖苷键随机断裂，生成短链糊精和小分子糖类，从而使粘度迅速下降，达到淀粉液化的作用。α-淀粉酶广泛应用于传统酿造、食品加工、纺织退浆等行业，是最重要的的工业应用酶制剂之一。目前现有的α-淀粉酶在较低温度下催化能力较差，催化效率较低。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于，提出一种产适冷α-淀粉酶菌株、构建方法和生产α-淀粉酶的方法，该菌株产生的α-淀粉酶催化能力强，能在较低温度快速催化。产适冷α-淀粉酶菌株、构建方法和生产α-淀粉酶的方法分为3项专利技术创造，每一项专利技术创造都具有相同的特定技术特征：产适冷α-淀粉酶，解决了在低温下催化能力受限的问题，属于一个总的专利技术构思，可以作为一件申请提出。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：产适冷α-淀粉酶菌株的构建方法，包括如下步骤：(1)取海泥，构建宏基因组文库；(2)进行α-淀粉酶基因的筛选，得到含有α-淀粉酶基因的阳性克隆；(3)α-淀粉酶基因的克隆：a.基于筛选得到的α-淀粉酶基因的开放阅读框序列，设计扩增引物A15’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和引物A25’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，以含有α-淀粉酶基因的阳性克隆提取的质粒为模板，进行PCR扩增；凝胶回收PCR产物，纯化，插入载体并转化到感受态细胞中，筛选阳性克隆；提取阳性克隆的质粒，测序，确定重组质粒的插入片段序列，确定PCR纯化产物为α-淀粉酶基因；b.测序正确后，将步骤a的PCR纯化产物连接到pET-28(+)载体上得到二次扩增模板，使用以下两种引物对二次扩增模板进行扩增：F15’-CGCGGATCCAATGAACAATATCCGGTAC-3’和R15’-GCGAAGCTTAGCATGTTTGGCGAAAAAT-3'，扩增产物为α-淀粉酶基因，测序；c.pET-20b载体和扩增产物分别用BamHI和HindIII进行双酶切并连接，扩增产物α-淀粉酶基因插入载体pET-20b后得到带有α-淀粉酶基因的表达载体并转化大肠杆菌BL21，再接种带有α-淀粉酶基因的大肠杆菌BL21于含有一定浓度氨苄青霉素的LB培养基中，筛选得到含有α-淀粉酶基因的大肠杆菌BL21；(3)对筛选得到的含有α-淀粉酶基因的大肠杆菌BL21进行质粒提取，测序验证。通过构建宏基因组文库，通过α-淀粉酶筛选得到新的酶。所述的筛选的基因插入α-淀粉酶基因的表达载体。产适冷α-淀粉酶菌株的构建方法，包括如下步骤：(a)取海泥1g,利用试剂盒MOBIO的强力土壤DNA提取试剂盒(DNAIsolationKit)提取宏基因组。通过物理和化学协同破碎细胞的方法，将释放出来。通过过柱纯化以获得高质量。宏基因组文库构建过程中使用EPICENTRE公司的CopyControlFosmidLibraryProductionKits提供的质粒pCC2FOSTMVector及宿主菌EscherichiacoliEPI300，构建宏基因组文库。(b)取10uL文库菌液用液体培养基稀释到100uL，均匀涂布于α-淀粉酶筛选平板，37°培养3天，然后转入4°保存，观察菌落周围出现明显透明圈的即为α-淀粉酶阳性克隆。将筛选出来的阳性克隆挑出，液体培养，划线于α-淀粉酶筛选平板上重复验证。(c)基于找出的α-淀粉酶基因的开放阅读框序列，设计扩增引物A15’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和下游引物A25’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，PCR扩增；凝胶回收PCR产物，纯化，连接到载体上；(b)热激法转化到感受态细胞中，卡那霉素抗性筛选阳性克隆。采用质粒抽提试剂盒提取阳性克隆的质粒，送至上海公司测序，确定重组质粒的插入片段序列，PCR纯化产物为α-淀粉酶基因；(d)测序正确后，将步骤(c)的PCR纯化产物连接到pET-28(+)载体上得到二次扩增模板，使用以下两种引物对二次扩增模板进行扩增：F15’-CGCGGATCCAATGAACAATATCCGGTAC-3’和R15’-GCGAAGCTTAGCATGTTTGGCGAAAAAT-3'，扩增产物为α-淀粉酶基因，测序；(e)pET-20b载体和扩增产物分别用BamHI和HindIII进行双酶切并连接，扩增产物α-淀粉酶基因插入载体pET-20b后得到带有α-淀粉酶基因的表达载体并转化大肠杆菌BL21，再接种带有α-淀粉酶基因的大肠杆菌BL21于含有一定浓度氨苄青霉素的LB培养基中，筛选得到含有α-淀粉酶基因的大肠杆菌BL21；(f)对筛选得到的含有α-淀粉酶基因的大肠杆菌BL21进行质粒提取，测序验证。所述液体种子培养基的组成为：淀粉，10g；KH2PO4，4.0g；MgSO4，0.03g；蒸馏水1000mL。上述步骤(c)中，PCR反应体系为50μl，包括1μlDNA模板、5μl10×PCRbuffer、3μl25mMMgCl2、4μldNTPmixture、1μl20μM引物A1、1μl20μM引物A2、0.25μl、5U/μlTaq酶和34.75μl灭菌ddH2O；PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共28个循环；72℃5min。产适冷α-淀粉酶菌株生产α-淀粉酶的方法，其特征是，所述方法包括以下步骤：(1)产酶培养目标基因α-淀粉酶的转化株生长在含有表达质粒对应抗生素的发酵产酶培养基中，37℃恒温培养，直到吸光值OD600达到0.6—0.8，然后用IPTG进行诱导表达，环境温度仍然控制在37℃；经过一定时间后,诱导细胞离心，上清液用于蛋白分离；(2)硫酸铵沉淀分别取50mL上述粗酶液，按终浓度分别为40％，50％，60％，70％W/V要求，分别加入不同质量的硫酸铵，冰浴中持续搅拌充分沉淀后，低温离心，弃去上清，沉淀物用10mmol/L,pH5.5的醋酸缓冲液复溶，上清为所得粗酶液，测得上清液酶活；将粗酶液用20mmol/L,pH5.5的醋酸缓冲透析，除去残留的硫酸铵；(3)SephadexG-100凝胶过滤层析将上一步透析样品上样到含有10mmol/L,pH5.5的醋酸缓冲液的sephadexG-100凝胶柱中，进行sephadexG-100凝胶过滤层析分离，用含0.2mo1/LNaCI的醋酸缓冲液A进行洗脱，流速为1mL/min；将收集的样品进行活性测定，收集活性部分，透析脱盐后，冻干浓缩，即为纯化后的α-淀粉酶。上述步骤(1)中，所述发酵产酶培养基的组成为：可溶性淀粉，20g；MgSO4·7H2O，0.5g；NaCl，0.5g；FeSO4·7H2O，0.01g；琼脂，20g；蒸馏水，1000mL，pH6.0～6.5；IPTG添加终浓度1mM。相对于现有技术，本专利技术的有益效果是：(1)本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
产适冷α‑淀粉酶菌株的构建方法，包括如下步骤：（1）取海泥，构建宏基因组文库；（2）进行α‑淀粉酶基因的筛选，得到含有α‑淀粉酶基因的阳性克隆；（3）α‑淀粉酶基因的克隆：a.基于筛选得到的α‑淀粉酶基因的开放阅读框序列，设计扩增引物A1 5’‑TCCGTAGGTGAACCTGCGG‑3’和引物A2 5’‑TCCTCCGCTTATTGATATGC‑3’，以含有α‑淀粉酶基因的阳性克隆提取的质粒为模板，进行PCR扩增；凝胶回收PCR产物，纯化，插入载体并转化到感受态细胞中，筛选阳性克隆；提取阳性克隆的质粒，测序，确定重组质粒的插入片段序列，确定PCR纯化产物为α‑淀粉酶基因；b.测序正确后，将步骤a的PCR纯化产物连接到pET‑28(+)载体上得到二次扩增模板，使用以下两种引物对二次扩增模板进行扩增：F1 5’‑CGCGGATCCAATGAACAATATCCGGTAC‑3’和R1 5’‑GCGAAGCTTAGCATGTTTGGCGAAAAAT‑3'，扩增产物为α‑淀粉酶基因，测序；c.pET‑20b载体和扩增产物分别用BamHI和 HindIII进行双酶切并连接，扩增产物α‑淀粉酶基因插入载体pET‑20b后得到带有α‑淀粉酶基因的表达载体并转化大肠杆菌BL21，再接种带有α‑淀粉酶基因的大肠杆菌BL21于含有一定浓度氨苄青霉素的LB培养基中，筛选得到含有α‑淀粉酶基因的大肠杆菌BL21；d．对筛选得到的含有α‑淀粉酶基因的大肠杆菌BL21进行质粒提取，测序验证。...

【技术特征摘要】
1.产适冷α-淀粉酶菌株的构建方法，包括如下步骤：（1）取海泥，构建宏基因组文库；（2）进行α-淀粉酶基因的筛选，得到含有α-淀粉酶基因的阳性克隆；（3）α-淀粉酶基因的克隆：a.基于筛选得到的α-淀粉酶基因的开放阅读框序列，设计扩增引物A15’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和引物A25’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，以含有α-淀粉酶基因的阳性克隆提取的质粒为模板，进行PCR扩增；凝胶回收PCR产物，纯化，插入载体并转化到感受态细胞中，筛选阳性克隆；提取阳性克隆的质粒，测序，确定重组质粒的插入片段序列，确定PCR纯化产物为α-淀粉酶基因；b.测序正确后，将步骤a的PCR纯化产物连接到pET-28(+)载体上得到二次扩增模板，使用以下两种引物对二次扩增模板进行扩增：F15’-CGCGGATCCAATGAACAATATCCGGTAC-3’和R15’-GCGAAGCTTAGCATGTTTGGCGAAAAAT-3'，扩增产物为α-淀粉酶基因，测序；c.pET-20b载体和扩增产物分别用BamHI和HindIII进行双酶切并连接，扩增产物α-淀粉酶基因插入载体pET-20b后得到带有α-淀粉酶基因的表达载体并转化大肠杆菌BL21，再接种带有α-淀粉酶基因的大肠杆菌BL21于含有一定浓度氨苄青霉素的LB培养基中，筛选得到含有α-淀粉酶基因的大肠杆菌BL21；d．对筛选得到的含有α-淀粉酶基因的大肠杆菌BL21进行质粒提取，测序验证。2.根据权利要求1所述的产适冷α-淀粉酶菌株的构建方法，其特征在于：步骤（1）具体为：取海泥1g,利用DNA提取试剂盒提取宏基因组，通过物理和化学协同破碎细胞的方法，将DNA释放出来；采用质粒pCC2FOS™Vector及宿主菌EscherichiacoliEPI300构建宏基因组文库。3.根据权利要求1所述的产适冷α-淀粉酶菌株的构建方法，其特征在于：步骤（2）具体为：取10uL宏基因组文库菌液用液体种子培养基稀释到100uL，均匀涂布于α-淀粉酶筛选平板，37°培养3天，然后转入4°保存，观察到菌落周围出现明显透明圈的即为α-淀粉酶阳性克隆；将筛选出来的阳性克隆挑出，用液体种子培养基富集培养，划线于α-淀粉酶筛选平板上重复验证。4.根据权利要求3所述的产适冷α-淀粉酶菌株的构建方法，其特征是，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张李阳，霍光明，
申请(专利权)人：南京晓庄学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32