一种人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法技术

本发明专利技术涉及生物工程、特别是蛋白质工程技术领域。本发明专利技术提供一种人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法，本发明专利技术的人核糖体蛋白RPS5的原核表达不带标签，并通过工程菌破碎、变性蛋白阳离子交换层析纯化、变性蛋白阴离子交换层析纯化、变性蛋白复性以及凝胶过滤层析纯化，大大提高了人核糖体蛋白S5蛋白的表达量及总收率，也提高了最终产品的纯度，降低了生产成本，有利于大规模工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法
本专利技术涉及生物工程、特别是蛋白质工程
，涉及一种通过基因工程得到的重组蛋白－人核糖体蛋白S5的表达、提取、纯化方法。
技术介绍
人核糖体蛋白S5(ribosomalproteinS5,RPS5)是人类核糖体40S亚基上的一个蛋白，属于S7P核糖体蛋白家族，GenBank:AB061853.2；NCBIReferenceSequence:NM_001009.3。人们发现在肝硬化的肝星状细胞中该蛋白的表达异常，显示RPS5是潜在的药物作用靶点(参考文献：Wei-HengXu,Hong-GangHu,YuanTian,Shao-ZhanWang,JieLi,Jian-ZhongLi,XingDeng,HuiQian,LeiQiu,Zhen-LinHu,Qiu-YeWu,Yi-FengChai,ChengGuo,Wei-FenXie,andJun-PingZhang.BioactiveCompoundRevealsaNovelFunctionforRibosomalProteinS5inHepaticStellateCellActivationandHepaticFibrosis[J].HEPATOLOGY.2014；60:648-660.)。中国专利技术专利申请CN201310057096.0公开了核糖体蛋白S5在催化蛋白质分子发生脱磷酸化反应中的用途，申请公布号为CN103160557A。据文献报道，带有六聚组氨酸标签的RPS5已能大量表达并且形成包涵体，在变性条件下纯化后，通过稀释法复性(参考文献：AlexeyMalygin,OxanaBaranovskaya,AntonIvanov,andGalinaKarpova.ExpressionandpurificationofhumanribosomalproteinsS3,S5,S10,S19,andS26[J].ProteinExpressionandPurification.2003；28:57-62.)，但是六聚组氨酸标签还得后期去除，不仅工艺复杂而且成本提高。另外，目前的重组表达的RPS5蛋白最终产品存在产量低、纯度低的缺陷。不带标签的RPS5的表达纯化方法目前尚未见文献报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法。本专利技术旨在提供一种不带标签的RPS5的制备方法，涉及人核糖体蛋白RPS5的原核表达载体构建、原核表达及提取、纯化、复性的方法；该方法能够有效解决RPS5蛋白最终产品产量低、纯度低的缺陷。本专利技术人研究发现，不带标签的RPS5的表达纯化的技术难度主要在表达时培养基的优化、初步纯化后蛋白的复性等地方。本专利技术人设计阳离子交换层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析相结合的技术方案，并进一步筛选了各步层析所用的方法和参数，特别改变同一种缓冲液梯度层析的方法，用不同的缓冲液组合，并优化配比、浓度、pH值等条件，最终完成本专利技术。本专利技术的第一方面，提供一种人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法。所述的人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法，包括以下步骤：A、RPS5的原核表达及工程菌破碎B、RPS5变性蛋白阳离子交换层析纯化C、RPS5变性蛋白阴离子交换层析纯化D、RPS5变性蛋白复性E、RPS5蛋白凝胶过滤层析纯化步骤A，原核表达RPS5后，所述的RPS5工程菌破碎方法具体为：4℃高速离心收集原核表达RPS5的工程菌的菌体，按照1g菌体湿重使用10mL第一缓冲液悬浮，置于冰上超声破碎，参数为功率300w、工作时间3s、间隙时间3s、工作次数99次，高速离心去掉上清；直到离心上清液淡黄色消失为止。所述的原核表达RPS5的方法，较优的，原核表达所用的LB培养基中添加1％～10％(质量体积比)的葡萄糖或者甘油，优选5％的葡萄糖。本专利技术经实验发现，在大肠杆菌原核表达时所用的培养基中添加葡萄糖或甘油，RPS5可得到大量表达。所用的原核表达载体可选自：pET-28a(+)等。所述的工程菌，可选自大肠杆菌BL21(DE3)、Rosetta(DE3)等。步骤B，所述RPS5变性蛋白阳离子交换层析纯化方法具体为：在第二缓冲液条件下溶解RPS5包涵体蛋白，高速离心去掉不溶物，上清液上样于阳离子交换层析柱，使用第二缓冲液充分洗涤杂蛋白，使用第三缓冲液再次充分洗去杂蛋白，最后使用第四缓冲液洗脱目的蛋白。所述的阳离子交换层析柱可选自：CM阳离子交换层析柱、SP阳离子交换层析柱等。步骤C，所述RPS5变性蛋白阴离子交换层析纯化方法具体为：使用第八缓冲液透析从阳离子层析柱洗脱下来的目的蛋白溶液，在第八缓冲液条件下，将目的蛋白上样于阴离子交换层析柱，收集穿透液。所述的阴离子交换层析柱可选自：DEAE阴离子交换层析柱、Q阴离子交换层析柱等。步骤D，所述RPS5变性蛋白复性的方法具体为：在4℃条件下，使用透析的方法逐步降低变性剂浓度至完全去除变性剂来复性RPS5蛋白。优选的方法为：纯化好的RPS5变性蛋白溶液开始透析于第九缓冲液中6h以上，然后每隔3h使用预冷的第十缓冲液置换1/5、2/5、3/5、4/5体积的透析液，最后完全使用第十缓冲液透析蛋白溶液两次；高速离心得到的上清液即为复性的RPS5蛋白溶液；复性的RPS5蛋白溶液保存于4℃条件下。步骤E，所述RPS5蛋白凝胶过滤层析纯化方法具体为：使用截留分子量为10kDa的超滤管浓缩复性好的RPS5蛋白，上样于预先使用第十缓冲液平衡好的凝胶过滤层析柱，使用第十缓冲液洗脱至出峰，收集蛋白峰。所述的凝胶过滤层析柱可选自：Superdex75凝胶过滤层析柱、SephadexG75凝胶过滤层析柱等。本专利技术所述各个缓冲液成分的配比和浓度分别为：第一缓冲液：40-60mmol/L(优选50mmol/L)NaH2PO4pH7.2第二缓冲液：8mol/L尿素/40-60mmol/L(优选50mmol/L)NaH2PO4pH7.2第三缓冲液：8mol/L尿素/20mmol/LNaCl/40-60mmol/L(优选50mmol/L)NaH2PO4pH7.2第四缓冲液：8mol/L尿素/300mmol/LNaCl/40-60mmol/L(优选50mmol/L)NaH2PO4pH7.2第五缓冲液：1mmol/LDTT/40-60mmol/L(优选50mmol/L)NaH2PO4pH7.2第六缓冲液：1mmol/LDTT/20mmol/LNaCl/40-60mmol/L(优选50mmol/L)NaH2PO4pH7.2第七缓冲液：1mmol/LDTT/300mmol/LNaCl/40-60mmol/L(优选50mmol/L)NaH2PO4pH7.2第八缓冲液：8mol/L尿素/10mmol/L-30mmol/L(优选20mmol/L)TrispH8.0第九缓冲液：8mol/L尿素/50mmol/L-150mmol/L(优选100mmol/L)Hepes/1mmol/LDTTpH7.2第十缓冲液：50mmol/L-150mmol/L(优选100mmol/L)Hepes/1mmol/LDTTpH7.2本专利技术研究发现，在RPS5的复性过程及复性后的蛋白缓冲液系统中不能含有NaCl等无机盐，否则RP本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法，所述的方法包括以下步骤：A、RPS5的原核表达及工程菌破碎；B、RPS5变性蛋白阳离子交换层析纯化；C、RPS5变性蛋白阴离子交换层析纯化；D、RPS5变性蛋白复性；E、RPS5蛋白凝胶过滤层析纯化。

【技术特征摘要】
1.一种人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法，所述的方法包括以下步骤：A、RPS5的原核表达及工程菌破碎；B、RPS5变性蛋白阳离子交换层析纯化；C、RPS5变性蛋白阴离子交换层析纯化；D、RPS5变性蛋白复性；E、RPS5蛋白凝胶过滤层析纯化。2.根据权利要求1所述的人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法，其特征在于，步骤A中，RPS5的原核表达的工程菌用大肠杆菌，表达所用的LB培养基中添加1％～10％的葡萄糖或者甘油。3.根据权利要求1或2所述的人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法，其特征在于，步骤A中，4℃高速离心收集原核表达RPS5的工程菌的菌体，按照1g菌体湿重使用10mL第一缓冲液悬浮，置于冰上超声破碎，参数为功率300w、工作时间3s、间隙时间3s、工作次数99次，高速离心去掉上清；直到离心上清液淡黄色消失为止；所述的第一缓冲液为：40-60mmol/LNaH2PO4，pH7.2。4.根据权利要求1或2所述的人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法，其特征在于，步骤B中，在第二缓冲液条件下溶解RPS5包涵体蛋白，高速离心去掉不溶物，上清液上样于阳离子交换层析柱，使用第二缓冲液充分洗涤杂蛋白，使用第三缓冲液再次充分洗去杂蛋白，最后使用第四缓冲液洗脱目的蛋白；所述的第二缓冲液为：8mol/L尿素和40-60mmol/LNaH2PO4，pH7.2；所述的第三缓冲液为：8mol/L尿素、20mmol/LNaCl和40-60mmol/LNaH2PO4，pH7.2；所述的第四缓冲液为：8mol/L尿素、300mmol/LNaCl和40-60mmol/LNaH2PO4，pH7.2。5.根据权利要求1或2所述的人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法，其特征在于，步骤C中，使用第八缓冲液透析从阳离子柱洗脱下来的目的蛋白溶液，在第八缓冲液条件下，将目的蛋白上样于阴离子交换柱，收集穿透液；所述的第八缓冲液为：8mol/L尿素和10mmol/L-30mmol/LTris，pH8.0。6.根据权利要求1或2所述的人核糖体蛋白S5的表达提取纯化方法，其特征在于，步骤D中，在4℃条...

【专利技术属性】
技术研发人员：仲维清，邱丽娟，孟欣，罗春雷，杨峰，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海,31