一种猪松弛素的提取纯化方法技术

本发明专利技术提供了一种猪松弛素的提取纯化方法，包括如下步骤：(1)丙酮梯度抽提制备松弛素粗品；(2)阳离子交换层析；(3)疏水层析；(4)冷冻干燥；其中，步骤(1)的过程包括：将猪卵巢依次用盐酸、丙酮提取，所得提取液加入丙酮后低温处理，处理后所得沉淀经丙酮脱水后干燥得到松弛素粗品。本发明专利技术的方法制备的松弛素不仅收率高、纯度高、产量大，而且所得松弛素的结构和生物活性保存完整。

【技术实现步骤摘要】
一种猪松弛素的提取纯化方法
本专利技术属于生物制药
，涉及一种猪松弛素的提取纯化方法，更具体地涉及一种从猪卵巢中采用丙酮梯度抽提，离子交换层析和疏水层析技术分离纯化猪松弛素的方法。
技术介绍
松弛素是一种对母畜分娩前产道有松弛作用的多肽类激素，主要产生于哺乳动物妊娠期间卵巢中的黄体，其最初作为一种与哺乳动物生殖活动有关的多肽激素被发现。随着研究的深入，发现松弛素具有更广泛的生物学功能：如抑制胶原的形成与促进胶原酶合成，从而促进胶原的降解，在分娩时软化生殖道组织，抑制子宫收缩，促进骨盆韧带软化，刺激乳腺生长与分化；能够刺激多种器官与组织的血管扩张，抑制血小板凝集；刺激胰岛细胞分泌胰岛素，调节体内血糖；促进溃疡组织愈合；影响垂体激素分泌。由此可见，松弛素具有复杂的生物学作用和广阔的医学应用前景。目前国外已有报道，Connetics公司已将松弛素用于全身性硬皮病的治疗当中，并已完成了Ⅰ期、Ⅱ期临床试验。而国内在此方面的研究甚少。松弛素已从许多种生物中被提纯，包括猪、鼠、马、鲨、虎、大鼠、角鲨及人类。然而，如何获得高纯度的松弛素仍然是一个值得研究的课题。松弛素在动物体内含量低，且稳定性差，提取纯化难度高。高纯度松弛素需从卵巢组织中抽提出含有松弛素的粗品蛋白，再去除几乎所有的杂蛋白，其纯化工艺存在许多难点。如J.Doczi采用盐酸丙酮抽提，氯化锌盐析的方法，得到的松弛素纯度不高，并且高浓度的氯化锌对松弛素活性也有影响(O.D.Sherwood，IsolationandCharacterizationofPorcineandRatRelaxin，AdvancesinExperimentalMedicineandBiologypp115-138，1982,DOL10.1007/978-1-4613-3368-55)。C.DavidSherwood等人采用盐酸丙酮抽提、分子筛层析和离子交换层析的方法，得到了较高纯度的松弛素(C.D.SHERWOODetal,Purificationandcharacterizationofporcinerelaxin,ChemicalAbstractsBand80,Nr.13,1.April1974,Columbus,Ohio,USA)。但该法在分子筛层析过程中损失很大，并且不利于大规模生产；在离子交换洗脱后，存在相似电荷特性的杂蛋白，影响最终产品的纯度。后来采用的阳离子交换层析和阴离子交换层析结合的技术虽能制备纯度合适的样品，但是由于阴离子交换层析在吸附和洗脱时采用的高pH条件，会严重破坏松弛素的生物活性。另外CN102603888A公开了一种采用毕赤酵母菌制备人类松弛素-2的方法，其中从发酵液提取纯化人类松弛素-2需要反复进行数次微孔滤膜过滤，且需要3次色谱柱分离纯化操作，耗时较长。CN103788207A公开了一种从发酵液中提取纯化人类松弛素-2的方法，该方法包括将发酵液离心后过截流分子量3000的醋酸纤维素超滤膜过滤，依次上SephadexG-50柱和SynchropakRP-PC18反相HPLC层析柱进行层析纯化，然后通过低温旋蒸浓缩，冷冻干燥，得纯化的人类松弛素-2。该方法原料昂贵，不易获得，且难以保存松弛素结构和生物活性的完整。
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的缺点，本专利技术的目的在于提供一种猪松弛素的提取纯化方法。本专利技术的方法制备的松弛素不仅收率高、纯度高、产量大，而且所得松弛素的结构和生物活性保存完整。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种猪松弛素的提取纯化方法，包括如下步骤：(1)丙酮梯度抽提制备松弛素粗品；(2)阳离子交换层析；(3)疏水层析；(4)冷冻干燥；其中，步骤(1)的过程包括：将猪卵巢依次用盐酸、丙酮提取，所得提取液加入丙酮后低温处理，处理后所得沉淀经丙酮脱水后干燥得到松弛素粗品；低温例如可以为-10℃--40℃，例如-15℃、-19℃、-21℃、-26℃、-30℃、-35℃、-38℃等；将猪卵巢依次用盐酸、丙酮提取时所述丙酮与猪卵巢的量的比为1-5L/kg，例如为1.3L/kg、1.8L/kg、2.5L/kg、2.9L/kg、3.3L/kg、3.7L/kg、4.1L/kg、4.6L/kg、4.9L/kg等；提取液加入丙酮后低温处理时所述丙酮的体积为所述提取液的1-10倍，例如为1.5倍、2.3倍、3.0倍、3.5倍、5.0倍、7.0倍、8.5倍、9.0倍、9.7倍等。本专利技术的提取纯化方法利用酸性有机溶剂梯度，低浓度有机溶剂中溶解，高浓度有机溶剂中沉淀出来，对松弛素抽提制备粗品，低pH值的酸性有机溶剂不仅能够保持松弛素不受组织蛋白酶的破坏，还能够保护松弛素特有的二硫键结构；而且通过控制有机溶剂梯度，可以较精准的去除卵巢中的大部分杂蛋白和脂类物质；另外采用阳离子交换层析和疏水层析可最大限度去除松弛素以外的杂蛋白，并且保存松弛素结构和生物活性的完整。作为优选，步骤(1)的过程包括：(a)将冰冻的猪卵巢处理为小块，加入0-10℃，例如1.5℃、2.6℃、4℃、6℃、7.5℃、8.7℃、9.5℃等的盐酸，0-10℃下搅拌抽提1-5小时，再加入0-10℃，例如1.5℃、2.6℃、4℃、6℃、7.5℃、8.7℃、9.5℃等的丙酮，0-10℃下搅拌抽提2-10小时，静置5小时以上，优选10小时；(b)将步骤(a)所得抽提溶液0-10℃下离心；(c)取步骤(b)所得上清液加入-10℃--40℃，例如-15℃、-19℃、-21℃、-26℃、-30℃、-35℃、-38℃等的丙酮，搅拌后置0-10℃低温操作间10小时以上，优选为24小时；(d)将步骤(c)所得底部沉淀0-10℃下离心，然后沉淀经丙酮脱水后干燥即得所述松弛素粗品。作为优选，步骤(a)中所述猪卵巢经绞碎处理。优选地，所述盐酸与猪卵巢的量的比为0.1-1L/kg，优选为0.3-0.5L/kg。优选地，所述丙酮与猪卵巢的量的比为1-5L/kg，优选为2-2.5L/kg。优选地，所述盐酸的浓度为0.5-5mol/L，优选为1.5mol/L。优选地，所述搅拌抽提的温度为4-8℃。作为优选，步骤(b)中所述离心的转速为3000rpm，离心的时间为5分钟以上，优选为10分钟。作为优选，步骤(c)中所述丙酮的体积为所述上清液的1-10倍，优选为4倍。优选地，所述搅拌的时间为2分钟以上，优选为5分钟。作为优选，步骤(d)中所述离心的转速为4000rpm，离心的时间为5分钟以上，优选为10分钟。作为优选，步骤(2)的过程包括：将步骤(1)所得松弛素粗品溶解于平衡缓冲液中，离心后取上清液过滤，调节过滤液pH值和电导率值与平衡缓冲液一致，然后将过滤液上层析柱；上样完毕后，用洗涤缓冲液冲洗层析柱，再用洗脱液洗脱目的蛋白，收集洗脱液。优选地，所述平衡缓冲液为NH4Ac，pH为4-6.5，优选为5.0-6.0。优选地，所述平衡缓冲液为0.03-0.08mol/L的NH4Ac，优选为0.05mol/L的NH4Ac。优选地，所述松弛素粗品与平衡缓冲液的比例为1:10-20g/mL，例如为1:12g/mL、1:15g/mL、1:18g/mL等。优选地，所述洗涤缓冲液为0.03-0.08mol/LNH4Ac与0.01-0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪松弛素的提取纯化方法，包括如下步骤：(1)丙酮梯度抽提制备松弛素粗品；(2)阳离子交换层析；(3)疏水层析；(4)冷冻干燥；其中，步骤(1)的过程包括：将猪卵巢依次用盐酸、丙酮提取，所得提取液加入丙酮后低温处理，处理后所得沉淀经丙酮脱水后干燥得到松弛素粗品；将猪卵巢依次用盐酸、丙酮提取时所述丙酮与猪卵巢的量的比为1‑5L/kg；提取液加入丙酮后低温处理时所述丙酮的体积为所述提取液的1‑10倍。

【技术特征摘要】
1.一种猪松弛素的提取纯化方法，包括如下步骤：(1)丙酮梯度抽提制备松弛素粗品；(2)阳离子交换层析；(3)疏水层析；(4)冷冻干燥；其中，步骤(1)的过程包括：将猪卵巢依次用盐酸、丙酮提取，所得提取液加入丙酮后低温处理，处理后所得沉淀经丙酮脱水后干燥得到松弛素粗品；将猪卵巢依次用盐酸、丙酮提取时所述丙酮与猪卵巢的量的比为1-5L/kg；提取液加入丙酮后低温处理时所述丙酮的体积为所述提取液的1-10倍。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的过程包括：(a)将冰冻的猪卵巢处理为小块，加入0-10℃的盐酸，0-10℃下搅拌抽提1-5小时，再加入0-10℃的丙酮，0-10℃下搅拌抽提2-10小时，静置5小时以上，优选10小时；(b)将步骤(a)所得抽提溶液0-10℃下离心；(c)取步骤(b)所得上清液加入-10℃--40℃的丙酮，搅拌后置0-10℃低温操作间10小时以上，优选为24小时；(d)将步骤(c)所得底部沉淀0-10℃下离心，然后沉淀经丙酮脱水后干燥即得所述松弛素粗品。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(a)中所述猪卵巢经绞碎处理；优选地，所述盐酸与猪卵巢的量的比为0.1-1L/kg，优选为0.3-0.5L/kg；优选地，所述丙酮与猪卵巢的量的比为2-2.5L/kg；优选地，所述盐酸的浓度为0.5-5mol/L，优选为1.5mol/L；优选地，所述搅拌抽提的温度为4-8℃。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤(b)中所述离心的转速为3000rpm，离心的时间为5分钟以上，优选为10分钟；优选地，步骤(c)中所述丙酮的体积为所述上清液的4倍；优选地，所述搅拌的时间为2分钟以上，优选为5分钟；优选地，步骤(d)中所述离心的转速为4000rpm，离心的时间为5分钟以上，优选为10分钟。5.根据权利要求2-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)的过程包括：将步骤(1)所得松弛素粗品溶解于平衡缓冲液中，离心后取上清液过滤，调节过滤液pH值和电导率值与平衡缓冲液一致，然后将过滤液上层析柱；上样完毕后，用洗涤缓冲液冲洗层析柱，再用洗脱液洗脱目的蛋白，收集洗脱液。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述平衡缓冲液为NH4Ac，pH为4-6.5，优选为5.0-6.0；...

【专利技术属性】
技术研发人员：王斌，张新庆，赵贵吉，马锡峰，赵梦喆，
申请(专利权)人：日照岚山生化制品有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37