一种从发酵液中提取并纯化米尔贝霉素的方法技术

本发明专利技术公开了一种从发酵液中提取并纯化米尔贝霉素的方法。首先将米尔贝霉素发酵液絮凝、过滤，得菌丝渣；用非水溶性溶剂萃取菌丝渣，萃取液依次进行酸洗、浓缩、碱处理，再进行二次萃取；然后酸洗、降温沉淀，过滤取滤液上硅胶柱层析；解吸液进行衍生处理，二次硅胶柱层析，结晶，分离，到米尔贝霉素衍生物；将衍生物水解、萃取、浓缩、结晶、干燥，得到米尔贝霉素A3和A4含量大于80％的米尔贝霉素。该方法对生产设备的要求较低，条件温和，简单易操作，获得的米尔贝霉素纯度高，适宜进行规模化生产，经济效益明显。

【技术实现步骤摘要】
一种从发酵液中提取并纯化米尔贝霉素的方法
本专利技术涉及生物农药的提取、纯化方法，具体涉及从发酵液中提取米尔贝霉素，继而对其进行纯化，获得高纯度的米尔贝霉素的方法。
技术介绍
米尔贝霉素(milbemycins)于1967年由日本的sankyo公司的Aoki等人从Streptomyceshygroscopicussugsp,aureolacrimosus发酵液中分离出的一种具有十六环内酯混合物的抗生素。米尔贝霉素对各种螨类都有较高的防治效果。该天然产物的20种组分大多数对农业害虫具有广谱防治活性，如蚜、螨、黄褐天幕毛虫、肠道寄生虫以及其他危害作物及家畜的寄生虫。该药对害虫作用强烈，用药量少，对人畜安全，不污染环境，只杀害虫，不伤害天敌，也不易产生抗性，是目前最有前途的广谱、高效、新型无交叉抗性的生物杀虫剂。通过多年的结构改良，于1986年正式以商品名米尔贝肟(Milbemycinoxime)上市。米尔贝肟是米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4的肟衍生物，米尔贝肟的使用收到了很好的效果。有专家预测，它可以替代目前用于作物保护的有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯类及有机氯类化合物。目前米尔贝肟的主要制备途径是：从发酵液中提取米尔贝霉素A3和A4，然后经过半合成得到米尔贝肟。要进一步提高和推广米尔贝肟的使用，目前需主要从三方面进行技术改进：1、对菌种、发酵工艺进行改良，提高发酵液中米尔贝霉素A3和A4的单位；2、对A3和A4的提取、纯化工艺进行改进以提高收率和质量；3、改进半合成工艺，提高合成收率。通过三个生产阶段的技术提高，降低米尔贝肟的生产成本，为推广米尔贝肟在作物保护中的使用打下良好基础。目前关于米尔贝霉素，公开的专利和专利申请主要集中在两个方面：1、对于米尔贝霉素进行半合成的结构改良的工艺研究；2、对结构改良后的衍生物的制剂工艺及其使用方法研究。尚未见到关于从发酵液中提取、纯化米尔贝霉素的专利研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种从发酵液中提取并纯化米尔贝霉素的方法，尤其是米尔贝霉素的A3和A4两个组分。本专利技术的技术方案如下：一种从发酵液中提取并纯化米尔贝霉素的方法，包括以下步骤：1)将米尔贝霉素发酵液进行絮凝、过滤，得到菌丝渣；2)用非水溶性溶剂萃取菌丝渣，得到一次萃取液；3)将一次萃取液依次进行酸洗、浓缩、碱处理，然后用二次萃取溶剂萃取，得到二次萃取液；4)对二次萃取液进行酸洗，降温沉淀，过滤取滤液得一次纯化上柱液；5)用硅胶柱层析分离一次纯化上柱液，收集得一次层析液；6)对一次层析液中的米尔贝霉素进行衍生处理，然后用碱洗涤，浓缩，结晶，干燥晶体，再将晶体溶解，过滤取滤液得衍生纯化上柱液；7)用硅胶柱层析分离衍生纯化上柱液，收集得二次层析液；8)浓缩二次层析液，结晶，分离，得到米尔贝霉素衍生物晶体；9)将米尔贝霉素衍生物水解、萃取、浓缩、结晶、干燥得到米尔贝霉素A3和A4含量大于80％的米尔贝霉素。上述步骤1)是对米尔贝霉素发酵液进行絮凝和过滤。首先将米尔贝霉素发酵液加热，通常加热至60～80℃，保温30～60分钟，同时搅拌；然后加入絮凝剂进行絮凝，絮凝时间一般为30～60分钟；可采用的高分子絮凝剂例如有机絮凝剂聚丙烯酰胺PAM，无机絮凝剂例如聚合氯化铝、聚合硫酸铁等，也可以是这些絮凝剂不同比例的混合物；过滤前通常加入助滤剂，可选用的助滤剂例如：珍珠岩粉助滤剂、硅藻土助滤剂，用量为发酵液体积的0～3w/v％，优选为1～2w/v％，助滤剂粒度通常在40～80目；过滤得到湿菌丝渣。上述步骤2)对菌丝渣进行萃取：所述非水溶性溶剂为低分子酯类溶剂，优选醋酸丁酯、乙酸乙酯等；非水溶性溶剂的用量优选为每克湿菌丝渣2.5～5mL，萃取温度20～50℃，时间2～5小时，过滤收集萃取液；可重复对菌渣萃取，合并收集萃取液，。上述步骤3)中，对一次萃取液进行酸性洗涤的酸优选为盐酸或硫酸的水溶液，浓度为0.05-0.2mol/L，洗涤温度15-30℃，通常是在室温下，加入一次萃取液体积50％的酸性洗水，搅拌洗涤10～20分钟，静置40～60分钟，分离，排尽酸性洗涤废水。将酸洗后的一次萃取液进行真空浓缩，温度控制在50～90℃蒸尽萃取溶剂；然后加碱处理，pH控制在11～13之间，一般加入浓缩物体积的1～1.5倍的0.3mol/L的NaOH溶液，搅拌得到均一的粘稠料液；二次萃取溶剂选用低分子量的烃类溶剂，优选庚烷、己烷、甲苯、二甲苯等，控制萃取液中的米尔贝霉素单位为0.5-2.0万μg/mL，搅拌萃取30～40分钟，然后静置、分离，萃取两次，合并萃取液。上述步骤4)通过浓缩或稀释二次萃取液，控制米尔贝霉素单位8000～10000μg/mL(米尔贝霉素单位指米尔贝霉素的w/v浓度，下同)，用酸性洗水洗涤优选采用0.05mol/L的盐酸或硫酸水溶液，搅拌洗涤10～15分钟，静置0.5～1小时，分离排尽洗涤废水；然后降温至8～10℃，静置沉淀8～10小时，过滤分离沉淀，收集滤液得一次纯化上柱液。上述步骤5)进行一次层析所用硅胶优选为60～150目的干硅胶，层析柱的径高比为1:6；可用二次萃取溶剂浸泡干硅胶后装入层析分离柱。上柱：将一次纯化上柱液按1VB/小时的流量，1-2g/mL硅胶吸附量进行吸附；解析：解析液为裝柱用二次萃取溶剂∶醋酸丁酯(或乙酸乙酯)体积比为6:4～7:3的混合溶液，解析流量0.6-1.0VB/小时，用量5-6倍VB体积，收集米尔贝霉素A4色谱峰面积比≥30％(注：HPLC检测色谱峰面积比)的解吸液。上述步骤6)用衍生试剂、酸束缚剂对一次层析液进行衍生反应，衍生试剂优选为对硝基苯甲酰氯、邻硝基苯甲酰氯和/或苯甲酰氯，酸束缚剂优选为吡啶、二乙胺和/或三乙胺。在本专利技术的一个实施例中，将一次层析液进行真空浓缩至米尔贝霉素单位为2-4万μg/mL，控制温度28～30℃，加入米尔贝霉素总当量的2～2.5倍当量的衍生试剂和2.5～3倍当量的酸束缚剂，搅拌反应2～4小时，用HPLC检测控制反应时间，待色谱检测中米尔贝霉素的峰面积小于1％，即可终止反应。然后对反应液进行洗涤，可加入于反应液等体积的5％NaHCO3溶液，搅拌洗涤10～15分钟，静置30～40分钟，分离废水。对洗涤后的反应液进行真空浓缩，降温结晶，控制结晶终点温度5～10℃，分离收集潮晶，真空干燥除去有机溶剂；用二次萃取溶剂溶解上述衍生物结晶，控制溶液浓度1.5～3w/v％，过滤得衍生纯化上柱液。上述步骤7)进行二次层析所用硅胶优选为60～150目的干硅胶，层析柱的径高比为1:6，可用二次萃取溶剂浸泡干硅胶20-30分钟，装入层析分离柱。上柱：将衍生纯化上柱液按1VB/小时的流量，2～3g/mL硅胶吸附量进行吸附；解析：解析液为裝柱用的二次萃取溶剂∶醋酸丁酯(或乙酸乙酯)提交比为6:4～7:3的混合溶液，解析流量0.6-1.0VB/小时，用量5-6倍VB体积，收集米尔贝霉素A4面积比≥50％(HPLC检测色谱峰面积比)的解吸液。上述步骤8)将二次层析液进行真空浓缩，得粘稠物，加入二次萃取溶剂剂，控制温度为50-60℃，米尔贝霉素衍生物单位为8-10万μg/mL，然后降温结晶，控制结晶终点温度5～10℃，分离收集潮晶，于50-60℃真空干燥本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从发酵液中提取并纯化米尔贝霉素的方法，包括以下步骤：1)将米尔贝霉素发酵液进行絮凝、过滤，得到菌丝渣；2)用非水溶性溶剂萃取菌丝渣，得到一次萃取液；3)将一次萃取液依次进行酸洗、浓缩、碱处理，然后用二次萃取溶剂萃取，得到二次萃取液；4)对二次萃取液进行酸洗，降温沉淀，过滤取滤液得一次纯化上柱液；5)用硅胶柱层析分离一次纯化上柱液，收集得一次层析液；6)对一次层析液中的米尔贝霉素进行衍生处理，然后用碱洗涤，浓缩，结晶，干燥晶体，再将晶体溶解，过滤取滤液得衍生纯化上柱液；7)用硅胶柱层析分离衍生纯化上柱液，收集得二次层析液；8)浓缩二次层析液，结晶，分离，得到米尔贝霉素衍生物晶体；9)将米尔贝霉素衍生物水解、萃取、浓缩、结晶、干燥得到米尔贝霉素A3和A4含量大于80％的米尔贝霉素。

【技术特征摘要】
1.一种从发酵液中提取并纯化米尔贝霉素的方法，包括以下步骤：1)将米尔贝霉素发酵液进行絮凝、过滤，得到菌丝渣；2)用非水溶性溶剂萃取菌丝渣，得到一次萃取液；3)将一次萃取液依次进行酸洗、浓缩、碱处理，然后用二次萃取溶剂萃取，得到二次萃取液；4)对二次萃取液进行酸洗，降温沉淀，过滤取滤液得一次纯化上柱液；5)用硅胶柱层析分离一次纯化上柱液，收集得一次层析液；6)对一次层析液中的米尔贝霉素进行衍生处理，然后用碱洗涤，浓缩，结晶，干燥晶体，再将晶体溶解，过滤取滤液得衍生纯化上柱液；7)用硅胶柱层析分离衍生纯化上柱液，收集得二次层析液；8)浓缩二次层析液，结晶，分离，得到米尔贝霉素衍生物晶体；9)将米尔贝霉素衍生物水解、萃取、浓缩、结晶、干燥得到米尔贝霉素A3和A4含量大于80％的米尔贝霉素。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)采用的絮凝剂为聚丙烯酰胺、聚合氯化铝和/或聚合硫酸铁；过滤前加入助滤剂珍珠岩粉和/或硅藻土助滤。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)萃取用所述非水溶性溶剂为醋酸丁酯和/或乙酸乙酯，萃取温度20～50℃，萃取一次或多次，每次时间2～5小时，合并为一次萃取液。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)用0.05-0.2mol/L的盐酸或硫酸对一次萃取液进行酸洗；酸洗后真空浓缩蒸尽萃取溶剂，加碱使pH在11～13，搅拌得粘稠料液，然后用二次萃取溶剂进行萃取。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)通过浓缩或稀释二次萃取液，使其米尔贝霉素单位为8000～10000μg/mL，然后采用0.05mol/L的盐酸或硫酸进行酸洗，再降温至8～10℃，静置沉淀8～10小时，过滤分离沉淀，收集滤液得一次纯化上柱液。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)和步骤7)中硅胶柱所用硅胶为60～150目的干硅胶，用二次萃取溶剂浸泡后上柱，层析柱的径高比为1:6；所用解析液为二次萃取溶剂∶醋酸丁酯或乙酸乙酯体积比为6:4～7:3的混合溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：李华德，张洪兰，康正磊，
申请(专利权)人：北大医药重庆大新药业股份有限公司，北大方正集团有限公司，北大医疗产业集团有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆,50