红景天苷的发酵转化方法技术

本发明专利技术公开了一种红景天苷的发酵转化方法，所述方法包括：发酵培养重组大肠杆菌，发酵结束后，离心收集菌体；将菌体加入以葡萄糖和酪醇为底物的反应液中，进行红景天苷的生物合成。本发明专利技术通过发酵阶段积累葡萄糖苷转移酶并构建酶催化反应体系，以葡萄糖和酪醇作为底物转化生成红景天苷。通过不断优化发酵、转化阶段料液配方、反应条件及控制策略。按照本发明专利技术方法进行红景天苷的生产，可在短时间内获得较高的红景天苷产量，转化反应体系中红景天苷含量最高达9206mg/L，酪醇转化率达到80％以上。利用本方法制备红景天苷简单易行，成本低、能耗少，可用于红景天苷的工业化大规模生产，具有良好的经济效益和社会效益。有良好的经济效益和社会效益。

【技术实现步骤摘要】
红景天苷的发酵转化方法


[0001]本专利技术涉及发酵工程
，具体地说，涉及一种红景天苷的发酵转化方法。

技术介绍

[0002]红景天苷是红景天属植物中广泛存在的一种酚类化合物，是红景天属植物中主要的活性单体之一，具有抗辐射、抗氧化、增强免疫力、促进癌细胞凋亡等药理活性，广泛应用于医药、化妆品、食品行业。
[0003]随着对红景天苷作用机制的深入研究和药理作用的明确，其需求量进一步增加，传统的天然植物来源因生长环境、含量、分离提取工艺等条件限制无法满足市场需求，而化学合成法反应条件苛刻、容易造成环境污染且危废处理成本高昂，不利于工业化生产。
[0004]用基因改造的微生物经发酵制备红景天苷的方法反应条件温和、成本较低，生产原料来源广泛，是红景天苷工业化生产的主要趋势。但在目前公开的期刊和专利文献中，多采用重组酿酒酵母菌、红曲霉菌等真菌进行深层发酵制得，存在发酵周期较长，生物合成产量较低等问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种红景天苷的发酵转化方法。
[0006]为了实现本专利技术目的，本专利技术提供一种红景天苷的发酵转化方法，包括以下步骤：
[0007]A、发酵培养重组大肠杆菌BL21(DE3)E.coli
‑
(pHhis8
‑
4)
‑
UGTs，发酵结束后，离心收集菌体；
[0008]B、将步骤A所得菌体加入以葡萄糖和酪醇为底物的反应液中，进行红景天苷的生物合成。
[0009]重组大肠杆菌可参见US20190264221A1中说明书第119～147段。
[0010]前述的方法，步骤A包括以下子步骤：
[0011]A1、重组大肠杆菌BL21(DE3)E.coli
‑
(pHhis8
‑
4)
‑
UGTs种子液的制备；
[0012]A2、采用补的方式进行发酵培养。
[0013]步骤A2中，当发酵液OD
600nm
值达到2
‑
5(优选OD
600nm
值达到3)时，开始持续流加补料培养基，直至发酵液OD
600nm
值达到40且离心检测菌体含量达到10
‑
12％(体积百分数)时停止发酵。
[0014]所用种子培养基：大豆蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.0；
[0015]所用发酵培养基：甘油5g/L，酵母粉5g/L，大豆蛋白胨5g/L，磷酸氢二钾18g/L。磷酸二氢钾6.8g/L，硫酸钠0.7g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化铵3.2g/L，氯化钙0.01g/L。
[0016]所用补料培养基：酵母粉10g/L，大豆胨10g/L，甘油500g/L。
[0017]步骤A2中，补料培养基的流加速度优选为20mL/L
·
h。
[0018]进一步地，步骤A1包括：向种子培养基中接入种龄为7小时的重组大肠杆菌BL21(DE3)E.coli
‑
(pHhis8
‑
4)
‑
UGTs，于37
±
1℃培养至OD
600nm
值达到0.5
‑
1.0，即为种子液。
[0019]进一步地，步骤A2包括：将步骤A1所得种子液按0.02％
‑
0.04％(优选0.03％)的体积比接入发酵培养基中，在35
‑
38℃，压力0.05
±
0.01MPa的条件下进行发酵培养；待发酵液OD
600nm
值达到8
‑
10时，将温度降至23
‑
26℃继续培养。
[0020]反应初始溶氧为100％，发酵过程中溶氧控制在20％以上，通气控制在1
±
0.3VVM，转速控制在150
‑
450rpm，整个发酵过程中，控制发酵体系的pH为6.8
‑
7.0。优选地，用氨水调节体系pH值。
[0021]前述的方法，步骤B中所述反应液为：酪醇0.7g/L，葡萄糖30g/L，磷酸二氢钾10g/L，硫酸镁2.7g/L，氯化钙0.1g/L，以水配制。
[0022]步骤B包括：将108‑
109CFU/g菌体1.5kg加入装有反应液的反应罐中，反应罐的装液量为30L/50L，在35
‑
38℃，压力0.05
±
0.01MPa的条件下进行红景天苷的生物合成；
[0023]反应罐初始溶氧为100％，反应过程中控制溶氧不低于60％，整个生物合成过程中控制体系的pH值在7.2
‑
7.5。优选地，用氢氧化钠调节体系pH值。
[0024]进一步地，步骤B还包括在红景天苷生物合成过程中，向反应液中流加葡萄糖溶液和酪醇溶液的步骤。
[0025]优选地，待反应液中葡萄糖浓度消耗至2％开始流加葡萄糖溶液，控制反应液中葡萄糖浓度在2
‑
3％。
[0026]更优选地，葡萄糖溶液的流加速度相当于每升反应液每小时补加3
‑
6g葡萄糖。
[0027]优选地，待反应液中酪醇浓度消耗至0.03％开始流加酪醇溶液，控制反应液中酪醇浓度在2
‑
5mmoL/L。
[0028]更优选地，酪醇溶液的流加速度相当于每升反应液每小时补加200
‑
280mg酪醇。
[0029]步骤B中，当红景天苷含量增长小于100μg/mL时停止合成反应。
[0030]借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：
[0031]本专利技术通过发酵阶段积累葡萄糖苷转移酶并构建酶催化反应体系，以葡萄糖和酪醇作为底物转化生成红景天苷。通过不断优化发酵、转化阶段料液配方、反应条件及控制策略。按照本专利技术方法进行红景天苷的生产，可在短时间内获得较高的红景天苷产量，转化反应体系中红景天苷含量最高达9206mg/L，酪醇转化率达到80％以上。利用本方法制备红景天苷简单易行，成本低、能耗少，可用于红景天苷的工业化大规模生产，具有良好的经济效益和社会效益。
[0032](一)本工艺将大肠杆菌的常用碳源葡萄糖用甘油替换，并相应优化了发酵液中多种物料的配比，从而得到最优组合以降低生长速度防止酶形成包涵体，同时减少乙酸、谷氨酸等代谢物的累积，防止因反馈抑制阻碍葡萄糖苷转移酶的生成。
[0033](二)发酵培养过程中采用了梯度降温的控制策略，对不同培养基中降温的时间和范围进行了大量实验验证，最终确定了本专利技术中的温度控制条件。合适的温度能够有效调控生长速率，在获得较高菌体含量的同时防止包涵体形成，另外合适的温度能使肽链更好地折叠以提高葡萄糖苷酶活性。
[0034](三)本专利技术还协同优化了反应阶段葡萄糖和酪醇的反应浓度和离心菌体的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.红景天苷的发酵转化方法，其特征在于，包括以下步骤：A、发酵培养重组大肠杆菌BL21(DE3)E.coli
‑
(pHhis8
‑
4)
‑
UGTs，发酵结束后，离心收集菌体；B、将步骤A所得菌体加入以葡萄糖和酪醇为底物的反应液中，进行红景天苷的生物合成。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A包括以下子步骤：A1、重组大肠杆菌BL21(DE3)E.coli
‑
(pHhis8
‑
4)
‑
UGTs种子液的制备；A2、采用补的方式进行发酵培养；步骤A2中，当发酵液OD
600nm
值达到2
‑
5时，开始持续流加补料培养基，直至发酵液OD
600nm
值达到40且离心检测菌体含量达到10
‑
12％时停止发酵；所用种子培养基：大豆蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.0；所用发酵培养基：甘油5g/L，酵母粉5g/L，大豆蛋白胨5g/L，磷酸氢二钾18g/L，磷酸二氢钾6.8g/L，硫酸钠0.7g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化铵3.2g/L，氯化钙0.01g/L；所用补料培养基：酵母粉10g/L，大豆胨10g/L，甘油500g/L。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤A2中，补料培养基的流加速度为20mL/L
·
h。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤A1包括：向种子培养基中接入种龄为7小时的重组大肠杆菌BL21(DE3)E.coli
‑
(pHhis8
‑
4)
‑
UGTs，于37
±
1℃培养至OD
600nm
值达到0.5
‑
1，即为种子液；步骤A2包括：将步骤A1所得种子液按0.02％
‑
0.04％的体积比接入发酵培养基中，在35
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38℃，压力0.05
±

【专利技术属性】
技术研发人员：杨超，刘春，陈雪莹，张葵，
申请(专利权)人：北大医药重庆大新药业股份有限公司北大医疗产业集团有限公司，
类型：发明
国别省市：