一种基于离子液体的生物催化体系生产α-熊果苷的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于离子液体的生物催化体系生产α

【技术实现步骤摘要】
一种基于离子液体的生物催化体系生产
α
‑
熊果苷的方法


[0001]本专利技术涉及一种基于离子液体的生物催化体系生产α
‑
熊果苷的方法，属于酶工程技术领 域。

技术介绍

[0002]α
‑
熊果苷是一种重要的美白原料，作为源自植物的天然酪氨酸结构类似物，能够有效抑 制酪氨酸酶的活性，是一种天然、高效的酪氨酸酶抑制剂，目前已被广泛用于化妆品和医药 领域：(1)在化妆品行业，熊果苷是一种重要的皮肤美白原料，其不仅对皮肤的雀斑、老人 斑、黄褐斑有消褪作用，而且对皮肤的滋润、皮肤灼伤后的愈合和粉刺等也颇有疗效；(2) 在医药方面，熊果苷对于人体色素沉着病和黑色素瘤也具有特殊的疗效，是临床上应用最为 广泛的治疗药物。
[0003]随着人们对α
‑
熊果苷的深入研究，多项研究结果表明α
‑
熊果苷在生物活性上，相较于 β
‑
熊果苷具有一系列优势。因此，近年来，α
‑
熊果苷开始逐步开始取代β
‑
熊果苷，成为了 新一代熊果苷产品。
[0004]在生物法合成α
‑
熊果苷方面，已有研究表明通过植物细胞培养技术，包括棘胸蛙、骆驼 蓬人参等植物细胞培养物，以对苯二酚为底物，能合成细胞干重7％的α
‑
熊果苷，对苯二酚 转化率最高为80％。另外，更多研究着手于微生物的酶法转化生产α
‑
熊果苷，如表1所示。 2002年，日本研究小组报道用野油菜黄单胞菌wu
‑
9701冻干细胞作为生物催化剂，麦芽糖作 为葡萄糖供体，α
‑
熊果苷产量达到10.8g/L。2013年，也有国内课题组报道利用嗜麦芽黄单 胞菌，以麦芽糖为糖基供体，α
‑
熊果苷产量提高到30.6g/L。可见，采用微生物细胞或相应 的酶制剂法生产α
‑
熊果苷，具有周期短、得率高和产率高的特点，可规模化生产。
[0005]表1α
‑
熊果苷的酶法或微生物法转化
[0006][0007][0008]a:Nishimura T,et al.J Ferment Bioeng 1994,78:31
–
36；
[0009]b:Kurosu J,et al.J Biosci Bioeng.2002；93(3):328
‑
30；
[0010]c:R,et al.J Mol Catal B Enzym 2005,35:142
–
146；
[0011]d:Liu CQ,et al.World J Microbiol Biotechnol.2013,29(8):1391
‑
1398；
[0012]e:Kitao S,et al.Biosci Biotechnol Bi℃hem 1994,58:38
–
42；
[0013]f:Seo ES,et al.Enzyme Microb Technol 2009,45:355
–
360；
[0014]g:Seo DH,et al.Appl Microbiol Biotechnol 2012,94:1189
–
1197。
[0015]从上述文献报道可见，生物法合成的熊果苷的产量相较于化学合成法还具有较大的差距。

技术实现思路

[0016]针对现有技术存在的上述问题，本专利技术提供了一种基于离子液体的生物催化体系生产α
‑ꢀ
熊果苷的方法，主要基于离子液体和α
‑
熊果苷合成酶的结合建立了超分子催化体系，大幅提 升了熊果苷的产量。
[0017]本专利技术的技术方案如下。
[0018]本专利技术提供一种高效生产熊果苷的方法，所述方法包括将离子液体加入α
‑
糖苷酶中，获 得超分子催化剂；将所述超分子催化剂加入对苯二酚和蔗糖的混合反应体系，进行催化反应； 所述离子液体为甜菜碱壬二酸。
[0019]进一步地，所述甜菜碱壬二酸的添加量为1％
‑
3％。
[0020]更进一步地，所述甜菜碱壬二酸的添加量为2％
‑
3％。
[0021]进一步地，所述α
‑
糖苷酶以含α
‑
糖苷酶的纯化蛋白、粗酶液或细胞的形式存在。
[0022]更进一步地，所述α
‑
糖苷酶以粗酶液的形式存在；所述粗酶液是利用大肠杆菌高密度发 酵生产制得。
[0023]更进一步地，所述粗酶液的制备方法包括以下步骤：
[0024](1)活化大肠杆菌CGMCC No.13992，得到活化后的种子液；
[0025](2)将步骤(1)得到的种子液接种到发酵培养基中进行高密度发酵；
[0026](3)利用步骤(2)得到的发酵液制备粗酶液。
[0027]更进一步地，所述步骤(1)具体包括：将大肠杆菌CGMCC No.13992接种到LB平板， 35℃
‑
40℃培养8
‑
15h；挑取单菌落，接种到LB液体培养基，35℃
‑
40℃，200
‑
220rpm培养 8
‑
15h；将培养液按1％
‑
5％的接种量转接至种子液培养基中，35℃
‑
40℃，200
‑
220rpm培养 2
‑
5h，得到种子液。
[0028]更进一步地，所述步骤(2)具体包括：将所述种子液以体积浓度1％
‑
5％的接种量接种 到发酵培养基中，控制pH 6.5
‑
7.5，溶氧DO值大于30％，35℃
‑
40℃培养3
‑
5h后；加入终浓 度为10
‑
30g/L的α
‑
乳糖，同时补加10
‑
30g/L的甘油，控制发酵温度20℃
‑
30℃，控制pH 6.5
‑
7.5， 溶氧DO值大于30％，继续发酵10
‑
30h。
[0029]更进一步地，所述步骤(3)具体包括：将发酵液离心收集细胞后，用去离子水重新悬浮 细胞，使湿菌体的含量为8
‑
12g/L；破碎细胞后，离心处理，去除细胞碎片，得到澄清的粗 酶液。
[0030]进一步地，所述对苯二酚与蔗糖的浓度之比为1：50
‑
80。
[0031]更进一步地，所述对苯二酚与蔗糖的浓度之比为5.5
‑
7.5g/L：400g/L。
[0032]进一步地，所述催化反应的条件为25
‑
35℃，pH 6.5
‑
7.5。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效生产熊果苷的方法，其特征在于，所述方法包括将离子液体加入α
‑
糖苷酶中，获得超分子催化剂；将所述超分子催化剂加入对苯二酚和蔗糖的混合反应体系，进行催化反应；所述离子液体为甜菜碱壬二酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甜菜碱壬二酸的添加量为1％
‑
3％。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述α
‑
糖苷酶以含α
‑
糖苷酶的纯化蛋白、粗酶液或细胞的形式存在。4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述α
‑
糖苷酶以粗酶液的形式存在；所述粗酶液的制备方法包括以下步骤：(1)活化大肠杆菌CGMCC No.13992，得到活化后的种子液；(2)将步骤(1)得到的种子液接种到发酵培养基中进行高密度发酵；(3)利用步骤(2)得到的发酵液制备粗酶液。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括：将大肠杆菌CGMCCNo.13992接种到LB平板，35℃
‑
40℃培养8
‑
15h；挑取单菌落，接种到LB液体培养基，35℃
‑
40℃，200
‑
220rpm培养8
‑
15h；将培养液按1％
‑
5％的接种量转接至种子液培养基中，35℃
‑
40℃，200
‑
220rpm培养2
‑
5h，得到活化后的种子液。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括：将所述种子液以体积浓度1％
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：张嘉恒，王振元，吴称玉，陆跃乐，朱林江，陈小龙，
申请(专利权)人：深圳市萱嘉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：