本发明专利技术公开了糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3在催化多种底物生成糖苷化合物中的应用，属于微生物技术领域。本发明专利技术公开的糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3在催化多种底物生成糖苷化合物中的应用，通过特异性强且催化效率高的糖基转移酶UGT85A1和RrUGT3，采用生物合成的手段，利用菌体转化的方式来实现高效绿色的糖苷类化合物的生产。本发明专利技术利用糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3催化多种底物生成糖苷化合物，转化效率高，且底物杂泛性高，可用于大规模生产多种糖苷类化合物。糖苷类化合物。糖苷类化合物。
【技术实现步骤摘要】
UGT85A1或RrUGT3在催化多种底物生成糖苷化合物中的应用
[0001]本专利技术涉及微生物
，更具体的说是涉及糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3在催化多种底物生成糖苷化合物中的应用。
技术介绍
[0002]糖苷类化合物广泛存在于各种植物体中，它由糖基部分和非糖基部分组成，非糖基部分称之为苷元。许多糖苷化合物具有多种生物活性，具有重要的药用价值。其中代表性化合物例如天麻素，它存在于兰科植物天麻的块茎中，是中药天麻的有效成分之一，具有镇静、安眠、抗炎、抗氧化等多种生物活性，在临床上得到广泛应用；豆腐果苷也具有抗炎抗氧化的功能，同时也具有潜在的治疗抑郁症的能力；淫羊藿次苷具有抗疲劳抗氧化功能，可用于治疗高血压。
[0003]目前获取糖苷化合物主要从植物中提取或者通过化学合成。但是随着城市化进程的发展，可利用的植物资源逐渐减少，且植物体中糖苷化合物含量较低，从植物中提取的糖苷化合物成本高，工作量大，且产量远不能满足于人们的需要。因此急需寻找新的方法来生产糖苷化合物。
[0004]从19世纪80年代开始，人们开始利用化学合成的方法合成糖苷化合物中的天麻素。1980年周俊等人利用化学合成的手段，成功合成了天麻素，在此过程中，用到毒性较高的红磷和溴素，容易造成环境污染，且不利于实验者的安全[周俊，杨雁宾，杨崇仁，天麻素的化学合成Ⅱ，化学学报，1980，32(2)，162
‑
166]。2004年戴晓畅等人改进了化学合成方法，用三溴化磷代替化学合成过程中用到的红磷和溴素[戴晓畅，彭啸，吴松福，杨万松，毛宇，天麻素及其类似酚性糖甙的化学合成工艺研究，云南民族大学学报(自然科学版)，2004，3(2)，83
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85]，提高了收率，但是依然存在污染问题。2014年王多平简化了化学合成步骤，采用对羟基苯甲醇作为初始底物，不再需要催化加氢过程[王多平，天麻素的生产工艺，CN104072549A，2014]，但是该方法需要五乙酰葡萄糖作为糖基供体，之后再脱去乙酰基保护基团，步骤依然繁琐。与之相比，生物合成糖苷类化合物具有重大优势。
[0005]因此，提供糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3在催化多种底物生成糖苷化合物中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
[0006]有鉴于此，本专利技术提供了糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3在催化多种底物生成糖苷化合物中的应用，利用微生物全细胞催化合成糖苷化合物；具体是利用表达糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3的大肠杆菌转化烷基酚衍生物生成糖苷化合物。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3在催化多种底物生成糖苷化合物中的应用，即糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3具有底物杂泛性。
[0009]所述UGT85A1催化的底物为4
‑
羟基苯甲醇、3
‑
羟基苯甲醇、4
‑
(1
‑
羟乙基)苯酚、3
‑
(1
‑
羟乙基)苯酚、4
‑
羟基苯甲酸或3
‑
羟基苯甲酸；所述RrUGT3催化的底物为对甲酚、对乙酚、对异丙基酚、对丙基苯酚、3
‑
乙基苯酚、3
‑
甲酚、4
‑
羟基苯乙酮、4
‑
羟基苯丙酮、3
‑
羟基苯乙酮、3
‑
乙烯基苯酚、3
‑
羟基苯甲醛、4
‑
羟基苯甲醇、4
‑
羟基苯甲醛、3
‑
(1
‑
羟乙基)苯酚、4
‑
(1
‑
羟乙基)苯酚、2
‑
(4
‑
羟基苯基)异丙醇、4
‑
羟基苯甲酸、3
‑
羟基苯甲酸或3
‑
羟基苯甲醇。除本专利技术所列举底物外，带有酚羟基、醇羟基或羧基的酚类底物均在本专利技术保护范围内。
[0010]进一步，利用糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3催化底物生成糖苷化合物的方法如下：
[0011](1)将糖基转移酶UGT85A1和RrUGT3的基因分别整合至pCDFDuet
‑
1质粒，分别转化进大肠杆菌DH5α，获得pCDFDuet
‑1‑
UGT85A1质粒和pCDFDuet
‑1‑
RrUGT3质粒；再转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，分别获得转化有pCDFDuet
‑1‑
UGT85A1质粒的BL21(DE3)菌株和转化有pCDFDuet
‑1‑
RrUGT3质粒的BL21(DE3)菌株；
[0012](2)分别将转化有pCDFDuet
‑1‑
UGT85A1质粒的BL21(DE3)菌株和转化有pCDFDuet
‑1‑
RrUGT3质粒的BL21(DE3)菌株接种于含有50μg/ml链霉素的LB液体培养基，37℃，220rpm培养过夜，获得种子液；
[0013](3)分别按照体积比为1：100的接种量将种子液接种至培养基中，37℃，220rpm培养3
‑
4小时；
[0014](4)待OD
600
达0.6
‑
0.8时，加入1mM IPTG进行诱导，同时加入1mM糖基转移酶底物，30℃，220rpm进行发酵；
[0015](5)发酵48h后，将发酵液高速离心后收集上清液；
[0016](6)取上清液，等体积加入甲醇，混匀后高速离心取上清进行HPLC检测以及MS检测以测定产物生成；
[0017](7)以流速为1BV/h将步骤(5)的上清液加入到AB
‑
8大孔吸附树脂柱中；
[0018](8)向大孔吸附树脂柱中以2BV/h的流速加入水，以除去大孔吸附树脂柱中残留的上清液以及极性较大的杂质，同样的方法冲洗3
‑
5个柱体积；
[0019](9)在大孔吸附树脂柱中加入浓度为30％
‑
40％的乙醇水溶液进行洗脱，并收集乙醇水洗脱液，速率为1BV/h，洗脱3个柱体积；
[0020](10)将洗脱液进行旋蒸，蒸干后用甲醇进行溶解，再经HPLC制备得纯净的糖苷化合物；
[0021](11)利用核磁鉴定产物结构。
[0022]进一步，步骤(3)所述培养基包括但不限于M9CA培养基、LB培养基，适用于种子液培养的培养基均可。
[0023]进一步，M9CA培养基成分包括酪蛋白水解物2.0g/L、Na2HPO46.8 g/L、KH2PO43.0 g/L、NH4Cl 1.0g/L、NaCl 0.5g/L，使用时额外添加40g/L葡萄糖，2mM MgSO4以及0.1mM CaCl2。本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3在催化多种底物生成糖苷化合物中的应用。2.根据权利要求1所述的糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3在催化多种底物生成糖苷化合物中的应用，其特征在于，所述UGT85A1催化的底物为4
‑
羟基苯甲醇、3
‑
羟基苯甲醇、4
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(1
‑
羟乙基)苯酚、3
‑
(1
‑
羟乙基)苯酚、4
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羟基苯甲酸或3
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羟基苯甲酸；所述RrUGT3催化的底物为对甲酚、对乙酚、对异丙基酚、对丙基苯酚、3
‑
乙基苯酚、3
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甲酚、4
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羟基苯乙酮、4
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羟基苯丙酮、3
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羟基苯乙酮、3
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乙烯基苯酚、3
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羟基苯甲醛、4
‑
羟基苯甲醇、4
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羟基苯甲醛、3
‑
(1
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羟乙基)苯酚、4
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(1
‑
羟乙基)苯酚、2
‑
(4
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羟基苯基)异丙醇、4
‑
羟基苯甲酸、3
‑
羟基苯甲酸或3
‑
羟基苯甲醇。3.根据权利要求1所述的糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3在催化多种底物生成糖苷化合物中的应用，其特征在于，利用糖基转移酶UGT85A1或RrUGT3催化底物生成糖苷化合物的方法如下：(1)将糖基转移酶UGT85A1和RrUGT3的基因分别整合至pCDFDuet
‑
1质粒，分别转化进大肠杆菌DH5α，获得pCDFDuet
‑...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭斐，李盛英，杜磊，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：
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