一种他克莫司的分离纯化方法技术

本发明专利技术提供一种他克莫司的分离纯化方法，包括：1)将他克莫司发酵液使用陶瓷膜过滤，得到发酵液浓液；2)向所述发酵液浓液中加入乙醇得到混合体系，随后向所述混合体系中加入树脂进行吸附；3)使用乙醇溶液对吸附后的树脂进行洗脱，得到他克莫司层析粗品；4)对所述他克莫司层析粗品依次进行一次结晶，制备柱分离，二次结晶，得到他克莫司纯品。该分离纯化方法操作简单，成本低，能够高纯度高收率的得到他克莫司。莫司。莫司。

【技术实现步骤摘要】
一种他克莫司的分离纯化方法


[0001]本专利技术属于生物制药领域，涉及一种他克莫司的分离纯化方法。

技术介绍

[0002]他克莫司又名FK506，是从链霉菌属中分离出的发酵产物，是一种大环内酯类抗生素，同时也是一种强力的新型免疫抑制剂，其主要通过抑制白介素
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2(IL
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2)的释放，从而全面抑制T淋巴细胞，其免疫抑制活性是传统免疫剂环孢素A的10
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100倍。虽然已有文献报道了他克莫司的全合成方法，但其步骤繁琐、成本高、难度大，难以应用到工业化生产中。
[0003]目前，他克莫司主要是通过从发酵液中分离提取得到，但大多数能够产生他克莫司的菌株在发酵过程中还会产生子囊霉素和一些其他大环内酯杂质，这些杂质与他克莫司的结构非常类似，大大增加了从发酵液中提取他克莫司的难度。近年来，对他克莫司进行研究和分离纯化的方法越来越多，主要集中与对发酵菌丝体的萃取，大孔树脂分离，硅胶层析，高速逆流色谱，反相柱层析，银盐改性的硅胶或者树脂层析，正相柱制备等，然而这些方法无疑都会用到高成本的填料以及复杂的混合溶剂系统，有的甚至会用到乙腈、四氢呋喃等毒性较大的溶剂，仅适合实验室研究，难以应用到工业化生产中。因此，如何能够简单、低成本地从发酵液中以高纯度和高收率分离纯化得到他克莫司一直是本领域亟待解决的问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供一种他克莫司的分离纯化方法，该方法操作简单，能够以低成本得到高纯度高收率的他克莫司，有望于用到他克莫司的工业化生产中。
[0005]本专利技术提供一种他克莫司的分离纯化方法，包括以下步骤：
[0006]1)将他克莫司发酵液使用陶瓷膜过滤，得到发酵液浓液；
[0007]2)向所述发酵液浓液中加入乙醇得到混合体系，随后向所述混合体系中加入树脂进行吸附；
[0008]3)使用乙醇溶液对吸附后的树脂进行洗脱，得到他克莫司层析粗品；
[0009]4)对所述他克莫司层析粗品依次进行一次结晶，制备柱分离，二次结晶，得到他克莫司纯品。
[0010]如上所述的分离纯化方法，其中，步骤2)中，所述混合体系中乙醇的体积浓度为30～35％。
[0011]如上所述的分离纯化方法，其中，步骤3)中，所述使用乙醇溶液对吸附后的树脂进行洗脱，包括：
[0012]1)将所述吸附后的树脂装柱，得到第一树脂柱，并使所述第一树脂柱依次串联第二树脂柱与第三树脂柱；
[0013]所述第二树脂柱与所述第一树脂柱中的树脂相同且均为极性大孔树脂；
[0014]所述第三树脂柱中的树脂为非极性大孔树脂；
[0015]2)采用第一乙醇溶液对吸附后的树脂进行洗脱，待他克莫司从所述第二树脂柱中解吸后，采用第二乙醇溶液单独对第三树脂柱进行洗脱，得到所述他克莫司层析粗品；
[0016]所述第一乙醇溶液的体积浓度小于所述第二乙醇溶液的体积浓度。
[0017]如上所述的分离纯化方法，其中，所述极性大孔树脂选自华震HZ806、华震HZ826、华震HP2MG中的至少一种。
[0018]如上所述的分离纯化方法，其中，所述第一乙醇溶液的体积浓度为40～60％；和/或，
[0019]所述第二乙醇溶液的体积浓度为65～80％。
[0020]如上所述的分离纯化方法，其中，所述第一树脂柱中的树脂与所述第二树脂柱中的树脂以及所述第三树脂柱中的树脂的体积比为1:(2～3):(5～8)。
[0021]如上所述的分离纯化方法，其中，所述非极性大孔树脂选自三菱HP20、华震色谱3号、华震HZ818、华震HZ816、华震HZ820中的至少一种。
[0022]如上所述的分离纯化方法，其中，所述一次结晶包括：在50℃下，将所述他克莫司层析粗品在甲苯中溶解至质量浓度为10～20mg/L，再降至室温析晶12～15h，得到一次结晶粗品。
[0023]如上所述的分离纯化方法，其中，所述制备柱分离包括：将经过所述一次结晶后得到的粗品溶解，利用聚酰胺树脂作为制备柱填料进行所述制备柱分离，收集他克莫司馏分；
[0024]所述制备柱分离的色谱条件为：波长：214nm；色谱柱尺寸：50mm
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250mm；流动相：乙酸丁酯或甲苯与丙酮的混合溶剂，载样量：20g/L。
[0025]如上所述的分离纯化方法，其中，所述二次结晶包括：将他克莫司馏分浓缩至他克莫司的浓度为180～220mg/mL，在30℃下静置析晶，过滤后得到所述他克莫司纯品。
[0026]本专利技术所提供的他克莫司的分离纯化方法，通过陶瓷膜过滤可去除他克莫司发酵液中的大部分色素和极性杂质，再通过乙醇稀释、树脂吸附、洗脱、一次结晶、制备柱分离、二次结晶等技术手段，可以进一步除去色素及发酵液中的其他杂质，使他克莫司的纯度得到大幅提高。利用本专利技术的方法能够以较高的的收率得到纯度高达99％以上的他克莫司。
附图说明
[0027]图1为实施例3的他克莫司纯品液相色谱图。
具体实施方式
[0028]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术的实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0029]本专利技术提供一种他克莫司的分离纯化方法，包括以下步骤：
[0030]1)将他克莫司发酵液使用陶瓷膜过滤，得到发酵液浓液；
[0031]2)向发酵液浓液中加入乙醇得到混合体系，随后向混合体系中加入树脂进行吸附；
[0032]3)使用乙醇溶液对吸附后的树脂进行洗脱，得到他克莫司层析粗品；
[0033]4)对他克莫司层析粗品依次进行一次结晶，制备柱分离，二次结晶，得到他克莫司纯品。
[0034]本专利技术所使用的他克莫司发酵液为链霉菌发酵液，链霉菌发酵液中他克莫司的纯度通常为55～65％，除色素以及大极性杂质外，还包括子囊霉素与他克莫司异构体等与他克莫司结构非常相近的杂质，导致他克莫司的分离纯化难度大为增加。
[0035]步骤1)中，使用陶瓷膜过滤，能够分离出发酵液中的色素以及大极性杂质。经陶瓷膜过滤后，可以得到浓度增大，体积浓缩的发酵液浓液。经陶瓷膜过滤后所得到的发酵液浓液他克莫司的收率几乎无损失，发酵液浓液中他克莫司的含量与发酵液一致。
[0036]步骤2)中，向发酵液浓液中加入乙醇得到混合体系，再向混合体系中加入树脂吸附，可以使体系形成一个溶解
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吸附的动态平衡。具体的，乙醇能够溶解一定量的发酵液浓液中的他克莫司，这时溶解于乙醇体系中的他克莫司能够被树脂吸附，树脂吸附后又可以促进发酵液浓液中的他克莫司在乙醇中的溶解，形成往复循环，发酵液浓液中大部分的他克莫司就可以被树脂所吸附。
[0037]待检测到发酵液浓液中他克莫司的含量＜20μg/mL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种他克莫司的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将他克莫司发酵液使用陶瓷膜过滤，得到发酵液浓液；2)向所述发酵液浓液中加入乙醇得到混合体系，随后向所述混合体系中加入树脂进行吸附；3)使用乙醇溶液对吸附后的树脂进行洗脱，得到他克莫司层析粗品；4)对所述他克莫司层析粗品依次进行一次结晶，制备柱分离，二次结晶，得到他克莫司纯品。2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤2)中，所述混合体系中乙醇的体积浓度为30～35％。3.根据权利要求1或2所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤3)中，所述使用乙醇溶液对吸附后的树脂进行洗脱，包括：1)将所述吸附后的树脂装柱，得到第一树脂柱，并使所述第一树脂柱依次串联第二树脂柱与第三树脂柱；所述第二树脂柱与所述第一树脂柱中的树脂相同且均为极性大孔树脂；所述第三树脂柱中的树脂为非极性大孔树脂；2)采用第一乙醇溶液对吸附后的树脂进行洗脱，待他克莫司从所述第二树脂柱中解吸后，采用第二乙醇溶液单独对第三树脂柱进行洗脱，得到所述他克莫司层析粗品；所述第一乙醇溶液的体积浓度小于所述第二乙醇溶液的体积浓度。4.根据权利要求3所述的分离纯化方法，其特征在于，所述极性大孔树脂选自华震HZ806、华震HZ826、华震HP2MG中的至少一种。5.根据权利要求3或4所述的分离纯化方法，其特征在于，所述第一乙醇溶液的体积浓度为40～60％；和/或，所述第二乙醇溶液的体积...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵燕，何勇崴，张葵，
申请(专利权)人：北大医药重庆大新药业股份有限公司北大医疗产业集团有限公司，
类型：发明
国别省市：