人隐花色素蛋白I（hCRY1）的重组表达方法及其在制备放疗保护剂中的应用技术

本发明专利技术涉及人隐花色素蛋白I（hCRY1）的重组表达方法及其在制备放疗保护剂中的应用，所述方法包括hCRY1蛋白在原核生物中的重组表达、纯化、活性及功能性检测等步骤，通过该方法平均每升菌液可收获hCRY1约20‑25mg，产率远高于目前已知的其他方法，而成本经计算远低于真核表达纯化方法以及化学合成多肽方法。并且由本方法纯化获得的蛋白产物经验证具有射线吸收和放射损伤防护功能，是具有开发成为放疗保护类药物潜质的活性蛋白，可用作放疗保护剂。

Human cryptochrome protein I (hCRY1) and its application in the preparation of radiation protective agent for expression of recombinant

The present invention relates to human cryptochrome protein I (hCRY1) recombinant expression method and its application in radiation protective agent system, said method comprising the recombinant hCRY1 protein in prokaryotes expression, purification, activity detection and functional steps, through the method of average per liter of broth can be harvested about 20 25mg hCRY1 that rate is far higher than other methods currently known, but the cost is much lower than the calculated by eukaryotic expression and purification method and chemical synthesis method of peptide. The protein products purified by this method have been proved to have the function of ray absorption and radiation damage protection. They are active proteins which can be used as protective agents for radiation protection. They can be used as radiation protection agents.

【技术实现步骤摘要】
人隐花色素蛋白I（hCRY1）的重组表达方法及其在制备放疗保护剂中的应用
本专利技术涉及hCRY1蛋白的重组表达方法及其在制备放疗保护剂中的应用。
技术介绍
癌症是人类健康的最大敌人，全世界每年死于癌症的人数接近1000万人。在癌症的临床治疗中，手术、放疗及化疗是三种最主要的治疗方法，其中放疗因其适应症比较宽泛，选择性较大，70%以上的恶性肿瘤患者在其治疗的某个阶段都需要接受放疗。放射治疗的目的是最大限度地将放射剂量集中到病变区（靶区）内，杀灭肿瘤细胞，而周围正常组织或器官少受或免受不必要的照射，一些重要器官如脑干、晶体、脊髓、肾、性腺等，则需要特别保护。无论是传统放疗技术还是现代精确放疗技术，都不能做到在治疗肿瘤的同时完全保护正常组织，例如需要照射的肿瘤周围存在较多的重要器官或正常组织；肿瘤与正常组织或重要器官相互交错；肿瘤组织包绕重要器官等。因此，寻找一些尽可能地保护正常皮肤、组织、器官的方法就成为了放疗过程中减轻患者痛苦、提高治疗效果的关键所在。为此本专利申请表达并纯化了重组hCRY1——一种具有修复紫外照射损伤功能的蛋白质，并初步验证了该蛋白在射线吸收、紫外损伤防护中的作用。现代时间生物学认为，在自然界中从单细胞动物到高等生物，以及人类的所有生命活动均存在着按照一定规律运行的、周期性的生命活动现象。经过大量的实验研究证明，这种生命活动现象是明显的节律性活动，称为生物节律。1993年所发现的隐花色素基因（Cry）就是目前人们所发现的节律基因之一。隐花色素是一种能够感受蓝光和近紫外光(330-390nm)区域的光受体，在几乎所有种类的植物中都有所发现，同时在昆虫、哺乳动物中都有编码隐花色素的同源基因。不同种类的隐花色素都是由接受光信号的生色团和应答光信号的脱辅基蛋白组成，脱辅基蛋白部分共有两个结构域。其中位于N端的PHR结构域是高度保守的，该结构域与光裂解酶十分相似，是生色团的结合区域，但其却并不具有光裂解酶活性；而C端的DAS结构域则是一个在不同物种中长度变化较大的非保守区域，一般负责信号的输出。迄今为止，动物体内所发现的隐花色素主要有CRY1和CRY2两种，它们与光裂解酶家族共同调节生物体对于紫外线和蓝光小剂量照射的适应性反应，参与DNA光修复的调控，并与动物的生长、发育、磁感知及生理节律均有着密切的联系。与CRY2相比，CRY1参与的更多是光依赖型转录抑制，它与Baml1/CLOCK蛋白二聚体、Per1等节律相关蛋白直接作用，并在节律性生理周期中直接起负调控作用。紫外、X-ray等射线照射会导致细胞中产生DNA双链断裂，DNA双链断裂诱导细胞产生H2AXFOCI，后者在DNA双链断裂的修复中起重要作用，因此本实验通过免疫荧光的观察和量化细胞内H2AXFOCI的荧光强度来检测细胞的损伤程度，并进一步证实了hCRY1在放射损伤防护中的功能。由于动物中天然状态的CRY1含量低，分离获得大量天然产物十分困难。而多肽合成成本过高，缺乏作为药物生产的应用前景。迄今为止，亦无文献报道过动物CRY1蛋白的原核表达纯化方法。因此本研究探寻了一套原核表达纯化hCRY1的技术路线，通过构建其原核表达载体pET28a(+)-hCRY1，在E.coliBL21(DE3)中表达，并分离纯化出较高纯度的具有射线吸收及紫外损伤防护活性的重组蛋白，为进一步研究hCRY1提供了便利条件，也为将hCRY1开发成为新的放疗保护剂提供了理论基础。
技术实现思路
本专利技术涉及一种重组hCRY1蛋白的表达方法，特别涉及一种重组hCRY1蛋白的原核表达方法。本专利技术的重组hCRY1蛋白的原核表达方法包括以下步骤：构建表达质粒，诱导重组蛋白表达，纯化重组蛋白，重组蛋白活性及功能检测。其中优选的，上述构建表达质粒的步骤包括：将hCRY1连接入原核表达载体，如pET28a(+)。具体为：通过PCR扩增获得hCRY1基因，再与载体pET28a(+)分别用限制性内切酶XhoI与BamlI酶切后用T4DNA连接酶连接，最终获得重组表达质粒pET28a(+)-hCRY1。其中，优选的，hCRY1蛋白如SEQIDNO：1所示。其中优选的，上述诱导重组蛋白表达的步骤包括：将构建好的表达质粒转入宿主细胞后诱导表达，其中宿主细胞优选E.coliBL21(DE3)；其中优选在转入宿主细胞后，通过SDS-PAGE筛选表达量高的克隆细胞。具体为：将pET28a(+)-hCRY1转入感受态细胞E.coliBL21(DE3)中并涂板培养，次日挑数个(5个)不同的单菌落克隆分别接入含卡那霉素的LB培养基中，摇菌过夜后以1:100转接到新鲜的含卡那霉素的LB培养基中进行放大培养；于三角烧瓶中摇菌并诱导6h后离心收菌；将所收菌体用PBS洗涤并重悬，加入蛋白酶抑制剂PMSF后进行超声破碎；从每份破碎样品中取20μl样品进行SDS-PAGE分析，挑选出目标蛋白条带较亮、杂蛋白条带较弱（即表达量高）的克隆，-80℃保菌储存并命名为BL21-hCRY1-b。其中优选的，上述纯化重组蛋白的步骤包括，将诱导表达的菌株破碎，离心，获得包涵体，再将包涵体复性，经纯化后获得有活性的重组蛋白。其中，包涵体复性的步骤包括：洗涤包涵体，溶解包涵体，梯度透析，复性。具体为：用20ml新配置的包涵体洗涤液（溶液A）将包涵体重悬，离心保留沉淀；于洗涤后的沉淀中加入20ml新配置的包涵体溶解液（溶液B），先将沉淀吹打成小块，再进行超声破碎助溶，破碎完毕后放置于24℃摇床、100rpm溶解2h，溶解完毕后离心分离并保留上清，沉淀则再用适量溶解液重复上述步骤溶解，直至沉淀体积不再明显减少；将蛋白溶液装入透析袋中，于5L烧杯中用2L含6M尿素、50mMTris-base、50mMNaCl的透析液透析，并逐渐将透析液中尿素浓度降至3M；将装有蛋白溶液的透析袋从之前的透析液移至4L蛋白复性液（溶液C）中，于4℃环境室中搅拌透析24h；此后再将装有蛋白溶液的透析袋移入2L上样缓冲液（溶液D）中于4℃环境室中搅拌透析，直到透析袋内有明显的白色絮状析出且数量不再增多（约24-48h）。其中，包涵体洗涤液（溶液A）的配比为：50mMTris-base、0.5mMEDTA、50mMNaCl、1%TritonX-100、2M尿素，用NaOH调节pH至8.0；包涵体溶解液（溶液B）的配比为：50mMTris-base、0.5mMEDTA、50mMNaCl、8M尿素、1mMPMSF，用NaOH调节pH至8.0，蛋白复性液（溶液C）的配比为：100mMTris-base、400mM精氨酸、2M尿素、5mMEDTA、5mMGSH、0.5mMGSSG，用NaOH调节pH至8.0；上样缓冲液（溶液D）的配比为50mMTris-base、50mMNaCl，用NaOH调节pH至8.0。其中，纯化的步骤包括：镍柱纯化后，超滤置换。镍柱纯化的操作过程具体为：将透析后的蛋白液离心保留上清，用10KD超滤管浓缩蛋白体积，于4℃环境室中上样于预先用溶液D平衡好的1ml纯化镍柱中，收集流穿液并将其再次上样，重复多次以保证目的蛋白与镍柱充分结合，之后用上样缓冲液洗柱，将纯化柱侧壁上的残留样品洗净，用10ml含有40mM咪唑的上样缓冲液洗去纯化柱上结合的杂蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组人隐花色素蛋白I(hCRY1)的原核表达方法，其特征在于，包括以下步骤：构建表达质粒，诱导重组蛋白表达，纯化重组蛋白，重组蛋白活性及功能检测；其中纯化重组蛋白的步骤包括：将诱导表达的菌株破碎，离心，获得包涵体，再将包涵体复性，经纯化后获得有活性的重组蛋白；所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：1所示；其中包涵体复性的具体操作步骤为：1)包涵体的洗涤用20ml新配置的包涵体洗涤液将包涵体重悬，超声破碎，离心保留沉淀；2)包涵体的溶解于洗涤后的沉淀中加入20ml新配置的包涵体溶解液，先将沉淀吹打成小块，再进行超声破碎助溶；破碎完毕后放置于24℃摇床，100rpm溶解2h；溶解完毕后离心分离并保留上清，沉淀则再用溶解液重复上述步骤溶解，直至沉淀体积不再明显减少；最后将多次溶解后上清收集在一起，去除沉淀，制得蛋白溶液；3)梯度透析复性透析全程在4℃环境室中进行并保持磁力搅拌；将步骤2)所得蛋白溶液装入10kD透析袋中，于5L烧杯中用2L含6M尿素、50mM Tris‑base、50mM NaCl的透析液透析，并逐渐将透析液中尿素浓度降至3M；将装有蛋白溶液的透析袋从之前的透析液移至4L蛋白复性液中透析24h；此后再将装有蛋白溶液的透析袋移入2L上样缓冲液中进行透析，直到透析袋内有明显的白色絮状析出且数量不再增多，即完成；其中步骤1)中洗涤液配方为：50mM Tris‑base、0.5mM EDTA、50mM NaCl、1％Triton X‑100、2M尿素，用NaOH调节pH至8.0；步骤2)中溶解液配方为：50mM Tris‑base、0.5mM EDTA、50mM NaCl、8M尿素、1mM PMSF，用NaOH调节pH至8.0；步骤3)中蛋白复性液配方为：100mM Tris‑base、400mM精氨酸、2M尿素、5mM EDTA、5mM GSH、0.5mM GSSG，用NaOH调节pH至8.0；步骤3)中上样缓冲液配方为：50mM Tris‑base、50mM NaCl，用NaOH调节pH至8.0；其中构建表达质粒的步骤包括：将hCRY1基因片段连接入原核表达载体pET28a(+)，获得重组表达质粒pET28a(+)‑hCRY1；其中诱导重组蛋白表达的步骤包括：将构建好的表达质粒转入宿主细胞E.coli BL21(DE3)后诱导表达；其中在转入宿主细胞后，通过SDS‑PAGE筛选表达量高的克隆细胞；所述筛选过程中加入1mM诱导剂IPTG，24℃、200rpm诱导6h后离心收菌进行筛选；其中纯化的步骤包括，镍柱纯化后进行超滤置换。...

【技术特征摘要】
1.一种重组人隐花色素蛋白I(hCRY1)的原核表达方法，其特征在于，包括以下步骤：构建表达质粒，诱导重组蛋白表达，纯化重组蛋白，重组蛋白活性及功能检测；其中纯化重组蛋白的步骤包括：将诱导表达的菌株破碎，离心，获得包涵体，再将包涵体复性，经纯化后获得有活性的重组蛋白；所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示；其中包涵体复性的具体操作步骤为：1)包涵体的洗涤用20ml新配置的包涵体洗涤液将包涵体重悬，超声破碎，离心保留沉淀；2)包涵体的溶解于洗涤后的沉淀中加入20ml新配置的包涵体溶解液，先将沉淀吹打成小块，再进行超声破碎助溶；破碎完毕后放置于24℃摇床，100rpm溶解2h；溶解完毕后离心分离并保留上清，沉淀则再用溶解液重复上述步骤溶解，直至沉淀体积不再明显减少；最后将多次溶解后上清收集在一起，去除沉淀，制得蛋白溶液；3)梯度透析复性透析全程在4℃环境室中进行并保持磁力搅拌；将步骤2)所得蛋白溶液装入10kD透析袋中，于5L烧杯中用2L含6M尿素、50mMTris-base、50mMNaCl的透析液透析，并逐渐将透析液中尿素浓度降至3M；将装有蛋白溶液的透析袋从之前的透析液移至4L蛋白复性液中透析24h；此后再将装有蛋白溶液的透析袋移入2L上样缓冲液中进行透析，直到透析袋内有明显的白色絮状析出且数量不再增多，即完成；其中步骤1)中洗涤液配方为：50mMTris-base、0.5mMEDTA、50mMNaCl、1％TritonX-100、2M尿素，用NaOH调节pH至8.0；步骤2)中溶解液...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘长穿，黄文林，姚辰，陈帅，
申请(专利权)人：黄文林，潘长穿，
类型：发明
国别省市：湖北,42