一种自体CAR‑T细胞制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种自体CAR‑T细胞制备方法及其应用。是将构建的CD28‑CD137‑CD19‑CD3全长基因，用CRISPR/Cas9技术导入到患者T细胞制作成CAR‑T细胞，然后经过体外扩增后，回输到患者体内进行抗肿瘤治疗。与传统肿瘤治疗方法相比，该方法为细胞靶向性治疗，副作用小，而且经过基因修饰的T细胞可在其表面稳定的表达抗原结合域，识别靶抗原的同时，无MHC限制性，提高了肿瘤的治疗效果。

【技术实现步骤摘要】
一种自体CAR-T细胞制备方法及应用
本专利技术涉及医学、免疫学、细胞生物学和分子生物学领域，具体涉及一种自体CAR-T细胞制备方法及其应用。
技术介绍
免疫细胞疗法作为一种新的癌症治疗方法，其治疗效果在临床上得到越来越多的证实，CAR-T细胞(嵌合抗原受体T细胞)技术是利用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞免疫细胞疗法，在多种血液癌症治疗中展现了极高的优势，攻破实体瘤也指日可待，由于肿瘤免疫疗法在治愈肿瘤的同时又没有传统放疗、化疗的治疗毒性，所以免疫细胞疗法在肿瘤的治疗中具有广阔的前景。过继细胞治疗(ACT)因其在短时间内扩增和活化具有抗瘤活性的效应细胞，在临床研究中备受关注。TIL、CIK、NK、NKT和γδT这些用于ACT的细胞在临床应用研究中取得一定的疗效，但肿瘤抗原特异性、亲和力好的免疫细胞来源困难、数量较少，杀瘤活性和体内持续时间不足，制约了ACT的发展。T细胞可携带外源基因安全的进入人体内(KerkarSP."ModelT"cells:atime-testedvehicleforgenetherapyFrontiImmunol,2012；4:304-304)。T细胞容易获得，在体外可被有效地诱导，并能大量增殖，可根据T细胞的这些特点，采用现代基因转导技术，赋予T细胞新的特性，经过修饰的T细胞可在其表面稳定的表达抗原结合域，识别靶抗原的同时，无MHC限制性(ItoF,ChangAE(2013).Cancerimmunotherapy:currentstatusandfutureDirections.SurgOncoClinNAm,22(4):765-783.)。于是，研究者尝试使用基因修饰T细胞来解决制约ACT发展的问题，用来修饰T细胞的基因有TCR、CAR、促进免疫细胞增殖的细胞因子(如IL-2、IL-15)等。其中嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)是以能编码单链抗体-共刺激分子-免疫受体酪氨酸活化基因序列的嵌合分子的融合基因修饰T细胞。因其具有肿瘤抗原识别特异性强、亲和力高、非MHC限制性及可在体内外大量扩增的优点而受到较多关注。最新研究表明，采用初始T细胞(TN)或者中心记忆T细胞(TCM)，这些细胞比分化的T细胞具有更强大的体内杀伤活性。具体操作：可通过类T细胞干细胞标记物CD62L进行T细胞分选。例如，将来自癌症患者的PBMC与自体肿瘤细胞和磁珠共同培养，所述磁珠能通过CD3与CD28、CD40或CD28加CD40的组合来活化T细胞。CAR是人工构建的融合基因编码的跨膜分子，有胞外区、胞内区和跨膜区构成。胞外区的单链可变区(scFv)，负责特异性抗原的识别；胞内区负责信号的转导，当胞外区和抗原特异性结合后，胞内区启动细胞活化所需的信号，从而促进T细胞增殖、释放细胞因子、抗细胞凋亡等；跨膜区链接胞外区和胞内区，对每一个区域的不同设计直接影响CAR-T细胞功能的发挥。B淋巴细胞白血病和恶性淋巴瘤是原发于骨髓造血系统和淋巴结并弥漫全身的恶性肿瘤。传统的放化疗虽然有一定疗效，但没有选择性，对正常组织损伤很大。近年来，生物治疗方法广泛应用于肿瘤治疗，尤其是单克隆抗体，如rituximab并因其特异靶向性、高亲和性而收到了良好效果。单抗通过Fc段与效应细胞表面激活性受体FcγRⅠ/FcγRⅢ结合，从而介导杀伤作用，但具有免疫杀伤作用的T细胞因为表面缺乏上述受体而不能被有效介导，从而削弱了机体对肿瘤的免疫效应。用抗CD19修饰的CAR-T细胞能同时识别多种不同抗原，可以介导T细胞高效特异杀伤B淋巴细胞来源的肿瘤细胞，为解决肿瘤的免疫逃逸带来了曙光。CD19是较为理想的肿瘤相关抗原，它表达于除干细胞以外的B淋巴细胞发育的各个阶段，因此B细胞来源的恶性细胞均有CD19表达。有关研究表明CD19抗体scFv构建的CAR-T细胞具有高度亲和力和裂解原代B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)瘤细胞的作用(CooperLJ,ToppMS,SerranoLM,etal.T-cellclonescanberenderedspecificforCD19:towardtheselectiveaugmentationofthegraft-versus-B-lineageleukemiaeffect.Blood,2003；101(4):1637-1644.)。Kalos等人在用抗CD19修饰的第二代CAR-T细胞进行治疗进展性CLL时发现，CAR-T细胞在体内扩增速度快甚至可达1000倍以上，持续时间超过6个月。不但消除了肿瘤细胞，一部分细胞还以记忆性CAR-T在体内持续存在(KalosM,LevineBL,PorterDL,etal.Tcellswithchimericantigenreceptorshavepotentantitumoreffectsandcanestablishmemoryinpatientswithadvancedleukemia.SciTranslMed,2011；3(95):95ra73-95ra73)。B细胞成熟抗原表达于成熟B细胞和浆细胞表面，能促进两者的存活，B细胞成熟抗原是肿瘤坏死因子超家族成员，可结合B细胞活化因子和增殖诱导配体，在治疗多发性骨髓瘤上是一个有前景的靶目标。CD3是T淋巴细胞表面特异分子，功能是把TCR与外来结合的抗原信息传递到细胞内，启动细胞内的活化过程，在T细胞接受抗原刺激后发生激活的早期过程起重要作用。4-1BB又称CD137，是T细胞表面活化分子，在活化的T细胞上表达，4-1BB的参与可以放大已经被诱导的免疫应答。4-1BB与抗4-1BB的单克隆抗体相接触后可以刺激被抗原激活的、有肿瘤特异性杀伤活性的CD8+T淋巴细胞增殖，刺激干扰素-γ(IFN-γ)和其他Th1型细胞因子(IL-2)，肿瘤坏死因子(TNF-α)的生成、释放，并刺激对抗细胞凋亡的T细胞的保护。另外4-1BB有免疫调节效应。4-1BB配体(4-1BBL)可显著放大CD8+T淋巴细胞的应答。研究显示，在CAR中间加入共刺激分子4-1BB后得到的CAR-T细胞具有分泌跟过细胞因子和更强的增殖活性(CarpenitoC,MiloneMC,HassanR,etal.Controloflarge,establishedtumorxenograftswithgeneticallyretargetedhumanTcellscontainingCD28andCD137domains.ProcNatlAcadSciUSA,2009；106(9):3360-3365)。有关研究表明，CD28的跨膜区表达CAR的能力最强。CD28+4/1BB组合提供共刺激信号，当抗原刺激第一信号通路后，可以上调抗细胞凋亡基因的表达、促进IL2分泌。有关研究表明，CAR引入共刺激分子信号(如CD28、CD137、CD27、CD244等)，可提高T细胞的细胞毒性、增殖活性、存活时间，增加抗原诱导的细胞因子释放，上调抗细胞凋亡蛋白。这些作用可增强T细胞对目标肿瘤的杀伤作用(SongDG,YeQ,PoussinM,etal.CD27costimulationaugmentsthesurvivalandantitumoractivi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种自体CAR‑T细胞制备方法，其特征在于：包括步骤如下：(a)从肿瘤患者体内获得细胞样本并分离和激活，所述样本为T细胞或T细胞的祖细胞；(b)构建scFv‑CD28‑CD137‑CD19‑CD3；(c)制作pCAG‑T7‑CD28‑CD137‑CD19‑CD3‑gRNA重组质粒(d)转染T细胞；(e)体外培养扩增CAR‑T细胞群体；(f)CAR‑T细胞回输患者体内，进行抗肿瘤治疗。

【技术特征摘要】
1.一种自体CAR-T细胞制备方法，其特征在于：包括步骤如下：(a)从肿瘤患者体内获得细胞样本并分离和激活，所述样本为T细胞或T细胞的祖细胞；(b)构建scFv-CD28-CD137-CD19-CD3；(c)制作pCAG-T7-CD28-CD137-CD19-CD3-gRNA重组质粒(d)转染T细胞；(e)体外培养扩增CAR-T细胞群体；(f)CAR-T细胞回输患者体内，进行抗肿瘤治疗。2.根据权利要求1所述的自体CAR-T细胞制备方法，其特征在于：所述步骤(a)的具体操作流程为：1)抗凝血管抽取骨髓瘤患者外周血；2)向管中加入红细胞裂解液和等体积PBS，轻轻吹打成细胞悬液；3)另取两支离心管，加入LTS1077淋巴细胞分层液；用吸管吸取细胞悬液，在距离淋巴细胞分层液上方0.5-3cm处将细胞悬液小心而缓慢的加入，使细胞悬液重叠与淋巴细胞分层液上，2000r/min离心5-50min；4)取出离心管，移液管吸去最上层的血浆，移液枪吸取血装层下的单个核细胞置入离心管中，加入PBS，轻轻吹打均匀后再次离心，1500r/min，10min，去掉上清液，共洗涤2-5次；5)向去掉上清后的离心管内加入含灭活胎牛血清、青链霉素和RPMI-1640的培养基放置于37℃细胞培养箱中扩大培养；6)离心，收取外周血单核细胞，置于液氮罐中保存备用。3.根据权利要求2所述的自体CAR-T细胞制备方法，其特征在于：所述细胞裂解液和PBS等体积，细胞裂解液和PBS的总体积与抽取的外周血体积比为2:1-1:2。4.根据权利要求2所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢海涛，李相鲁，张严冬，
申请(专利权)人：广东万海细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44