用于制备视网膜组织和视网膜相关细胞的方法技术

本发明专利技术提供用于制备视网膜先祖细胞的方法，所述方法包括(1)第一步，其中通过将多能干细胞置于无血清培养基中的悬浮培养中来形成多能干细胞的团聚体，和(2)第二步，其中将步骤(1)中形成的团聚体置于无血清培养基或含血清培养基中的悬浮培养中，所述无血清培养基或血清培养基含有作用于骨形态发生蛋白(BMP)信号转导途径试剂但是不含作用于Sonic hedgehog信号转导途径试剂，从而制备含视网膜先祖细胞的团聚体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及制备视网膜组织和视网膜相关细胞如视网膜先祖细胞和视网膜层特异的神经细胞等的方法。
技术介绍
作为由多能干细胞制备三维视网膜组织的方法，被证明的是通过在无血清培养基中形成均质的多能干细胞的团聚体，将其在基底膜制剂存在下进行悬浮培养，并且在器官培养基中进行悬浮培养来获得多层视网膜组织的方法(非专利文献1和专利文献1)，以及通过在含有抑制Wnt信号途径的物质的无血清培养基中形成均质的多能干细胞的团聚体，将其在基底膜制剂存在下进行悬浮培养，并且在含血清培养基中进行悬浮培养来获得多层视网膜组织的方法(非专利文献2和专利文献2)。[文献列表]专利文献专利文献1：WO2011/055855专利文献2：WO2013/077425非专利文献非专利文献1：Nature，472，51-56(2011)非专利文献2：CellStemCell，10(6)，771-785(2012)专利技术概述专利技术要解决的问题需要开发由多能干细胞制备视网膜组织的方法。解决问题的手段本专利技术提供由多能干细胞制备视网膜组织和视网膜相关细胞如视网膜先祖细胞和视网膜层特异的神经细胞等的方法。因此，本专利技术提供：[1]用于制备视网膜先祖细胞的方法，所述方法包括(1)第一步，在无血清培养基中对多能干细胞进行悬浮培养以形成多能干细胞的团聚体，和(2)第二步，在无血清培养基或含血清培养基中对步骤(1)中形成的团聚体进行悬浮培养，所述无血清培养基或含血清培养基各自不含作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质而含有作用于BMP信号转导途径的物质，由此获得含视网膜先祖细胞的团聚体(下文中有时被称为本专利技术的制备方法1)；[2]用于制备视网膜组织的方法，所述方法包括(1)第一步，在无血清培养基中对多能干细胞进行悬浮培养以形成多能干细胞的团聚体，(2)第二步，在无血清培养基或含血清培养基中对步骤(1)中形成的团聚体进行悬浮培养，所述无血清培养基或含血清培养基各自不含作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质而含有作用于BMP信号转导途径的物质，由此获得含视网膜先祖细胞的团聚体，和(3)第三步，在无血清培养基或含血清培养基中对步骤(2)中形成的团聚体进行悬浮培养，所述无血清培养基或含血清培养基各自不含作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质、作用于BMP信号转导途径的物质和作用于Wnt信号途径的物质中的任一种，由此获得含有视网膜组织并且基本上不含非神经头部外胚层的团聚体(下文中有时被称为本专利技术的制备方法2)；[3]用于制备视网膜层特异的神经细胞的方法，所述方法包括(1)第一步，在无血清培养基中对多能干细胞进行悬浮培养以形成多能干细胞的团聚体，(2)第二步，在无血清培养基或含血清培养基中对步骤(1)中形成的团聚体进行悬浮培养，所述无血清培养基或含血清培养基各自不含作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质而含有作用于BMP信号转导途径的物质，由此获得含视网膜先祖细胞的团聚体，和(3)第三步，在无血清培养基或含血清培养基中对步骤(2)中形成的团聚体进行悬浮培养直至目标视网膜层特异的神经细胞出现，所述无血清培养基或含血清培养基各自不含作用于Sonichedgehog信号转导途径的物质、作用于BMP信号转导途径的物质和作用于Wnt信号途径的物质中的任一种，由此获得含有含目标视网膜层特异的神经细胞的视网膜组织并且基本上不含非神经头部外胚层的团聚体(下文中有时被称为本专利技术的制备方法3)；[4]前述[1]至[3]中任一项的方法，其中所述多能干细胞是灵长类动物多能干细胞；[5]前述[1]至[4]中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是人多能干细胞；[6]前述[1]至[5]中任一项所述的方法，其中所述步骤(1)和步骤(2)在血清代替物存在下进行；[7]前述[1]至[6]中任一项所述的方法，其中所述悬浮培养在不存在基底膜制剂的情况下进行；[8]前述[1]至[7]中任一项所述的方法，其中所述作用于BMP信号转导途径的物质是一个或多个选自由以下各项组成的组的蛋白质：BMP2、BMP4、BMP7和GDF7；[9]前述[1]至[8]中任一项所述的方法，其中所述作用于BMP信号转导途径的物质在自步骤(1)中的悬浮培养开始起的第1天至第15天之间被添加到所述培养基；[10]用于评估毒性或药物效力的试剂，所述试剂包含视网膜先祖细胞、视网膜组织或视网膜层特异的神经细胞，所述细胞或组织是通过前述[1]至[9]中任一项所述的方法制备的；[11]评估测试物质的毒性或药物效力的方法，所述方法包括将视网膜先祖细胞、视网膜组织或视网膜层特异的神经细胞与所述测试物质接触，并且检测所述物质对所述细胞或组织的影响，所述细胞或组织是通过前述[1]至[9]中任一项所述的方法制备的；[12]用于由视网膜组织的紊乱所致的疾病的治疗剂，所述治疗剂包含视网膜先祖细胞、视网膜组织或视网膜层特异的神经细胞，所述细胞或组织是通过前述[1]至[9]中任一项所述的方法制备的；[13]治疗由视网膜组织的紊乱所致的疾病的方法，所述方法包括移植有效量的视网膜先祖细胞、视网膜组织或视网膜层特异的神经细胞至需要所述移植的受试者，所述细胞或组织是通过前述[1]至[9]中任一项所述的方法制备的；[14]视网膜先祖细胞、视网膜组织或视网膜层特异的神经细胞，其用于治疗由视网膜组织的紊乱所致的疾病，所述细胞或组织是通过前述[1]至[9]中任一项所述的方法制备的；等等。专利技术效果根据本专利技术的制备方法，可以高效制备视网膜先祖细胞、视网膜组织或视网膜层特异的神经细胞。在本专利技术的制备方法中，因为视网膜先祖细胞、视网膜组织或视网膜层特异的神经细胞可以通过在不向培养基添加基底膜制剂的情况下(即，在不存在基底膜制剂的情况下)对团聚体进行悬浮培养来获得，获得的细胞或组织被来源于异源物种的组分污染的风险降低。根据本专利技术的制备方法，可以有效提供视网膜组织或视网膜相关细胞如视网膜先祖细胞和视网膜层特异的神经细胞以用于化学物质等的毒性或效力评估、移植治疗等目的。附图简述图1显示在不向培养基添加作用于BMP信号转导途径的物质的情况下，来源于RAX：：GFP敲入的人胚胎干细胞的团聚体在开始悬浮培养起的第18天的光本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于制备视网膜先祖细胞的方法，所述方法包括(1)第一步，在无血清培养基中对多能干细胞进行悬浮培养以形成多能干细胞的团聚体，和(2)第二步，在无血清培养基或含血清培养基中对步骤(1)中形成的团聚体进行悬浮培养，所述无血清培养基或含血清培养基各自不含作用于Sonic hedgehog信号转导途径的物质而含有作用于BMP信号转导途径的物质，由此获得含视网膜先祖细胞的团聚体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.08.23 JP 2013-1732851.用于制备视网膜先祖细胞的方法，所述方法包括
(1)第一步，在无血清培养基中对多能干细胞进行悬浮培养以形成多
能干细胞的团聚体，和
(2)第二步，在无血清培养基或含血清培养基中对步骤(1)中形成的团
聚体进行悬浮培养，所述无血清培养基或含血清培养基各自不含作用于
Sonichedgehog信号转导途径的物质而含有作用于BMP信号转导途径的
物质，由此获得含视网膜先祖细胞的团聚体。
2.用于制备视网膜组织的方法，所述方法包括
(1)第一步，在无血清培养基中对多能干细胞进行悬浮培养以形成多
能干细胞的团聚体，
(2)第二步，在无血清培养基或含血清培养基中对步骤(1)中形成的团
聚体进行悬浮培养，所述无血清培养基或含血清培养基各自不含作用于
Sonichedgehog信号转导途径的物质而含有作用于BMP信号转导途径的
物质，由此获得含视网膜先祖细胞的团聚体，和
(3)第三步，在无血清培养基或含血清培养基中对步骤(2)中形成的团
聚体进行悬浮培养，所述无血清培养基或含血清培养基各自不含作用于
Sonichedgehog信号转导途径的物质、作用于BMP信号转导途径的物质和
作用于Wnt信号途径的物质中的任一种，由此获得含有视网膜组织而基本
上不含非神经头部外胚层的团聚体。
3.用于制备视网膜层特异的神经细胞的方法，所述方法包括
(1)第一步，在无血清培养基中对多能干细胞进行悬浮培养以形成多
能干细胞的团聚体，
(2)第二步，在无血清培养基或含血清培养基中对步骤(1)中形成的团
聚体进行悬浮培养，所述无血清培养基或含血清培养基各自不含作用于
Sonichedgehog信号转导途径的物质而含有作用于BMP信号转导途径的
物质，由此获得含视网膜先祖细胞的团聚体，和
(3)第三步，在无血清培养基或含血清培养基中对步骤(2)中形成的团
聚体进行悬浮培养直至目标视网膜层特异的神经细胞出现，所述无血清培

\t养基或含血清培养基各自不含作用于Sonichedgehog信号转导途径的物
质、作用于BMP信号转导途径的物...

【专利技术属性】
技术研发人员：中野德重，笹井芳树，大曾根亲文，
申请(专利权)人：住友化学株式会社，国立研究开发法人理化学研究所，
类型：发明
国别省市：日本;JP