一种外周血单个核细胞的冻存液、冻存方法及复苏方法技术

本发明专利技术涉及一种外周血单个核细胞的冻存液、冻存方法及复苏方法，冻存液，包括如下体积百分比的组分：无血清培养基40‑60％、非渗透性保护剂15‑25％、渗透性保护剂5‑15％、透明质酸钠5‑15％和抗氧化物质5‑15％。本发明专利技术采用无血清培养基+非渗透性保护剂+渗透性保护剂+抗氧化物质的冻存液组合，可以有效的冻存细胞，在复苏后仍然具有较高的活细胞率，具有较高的应用价值，值得推广。

A cryopreservation solution, cryopreservation method and resuscitation method of peripheral blood mononuclear cells

The invention relates to a cryopreservation solution, a cryopreservation method and a resuscitation method for peripheral blood mononuclear cells. The cryopreservation solution comprises the following components in volume percentage: serum-free medium 40 \u2011 60%, non-permeable protective agent 15 \u2011 25%, permeable protective agent 5 \u2011 15%, sodium hyaluronate 5 \u2011 15% and antioxidant 5 \u2011 15%. The invention adopts the combination of serum-free culture medium + non-permeability protectant + permeability protectant + antioxidant, which can effectively freeze and store cells, still has high living cell rate after recovery, has high application value and is worth popularizing.

【技术实现步骤摘要】
一种外周血单个核细胞的冻存液、冻存方法及复苏方法
本专利技术涉及细胞冻存
，具体涉及一种外周血单个核细胞的冻存液、冻存方法及复苏方法。
技术介绍
外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)是外周血中具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞(lymphocyte)、单核细胞(monocyte)、树突状细胞(DendriticCells,DC)等。对外周血单个核细胞进行冻存并能够有效的维持其活力和功能，对于基础医学和临床应用均具有重要的意义。对外周血单个核细胞进行冻存储存处理，可以有效解决现有的免疫细胞诱导周期长，且多次诱导和多次采血等问题，还可以把人在健康状态时最佳的免疫细胞储存起来，以备未来所需，如可用于储存者的肿瘤细胞治疗及抗衰老等。冻存液的选择以及复苏的方式对于PBMC冻存和复苏活性至关重要，选择不当的冻存液或复苏不当可能会给PBMC造成不可逆的损伤。外界温度降低至-80℃时，PBMC的活性将随着冷冻时间的延长而骤降，一旦温度降低至-196℃时，PBMC的所有生物学过程几乎停滞，因此要长期保存PBMC，液氮温度是最佳的储存温度。目前为止使用较多的冷冻保护剂是二甲基亚砜(DMSO)，可以迅速渗透入细胞，增加细胞膜对水的通透性，使水分在细胞冻结前渗出细胞外，并形成冰晶，保护细胞膜和细胞器免受损伤。DMSO是一种有毒溶剂，高浓度DMSO对细胞伤害较大，所以必须添加其他成分降低DMSO浓度，减少对冻存细胞的伤害。专利公开号CN104026118A公开了一种采用DMSO，人供体血浆及免疫细胞基础培养基的冻存液，虽然该方法不会引入外源性蛋白，但该冻存细胞的存活率仍然较低。专利公开号CN104719282A公开了一种采用DMSO，右旋糖酐-40和勃脉力A的冻存方案，使用该方案获得的PBMC复苏活率平均在84.03％，还有待提高。而且该专利仅记载细胞冻存液(20％DMSO+2％右旋糖酐40+勃脉力A)的复苏数据，DSMO的用量依然较高，而低用量DMSO用量的细胞活率不可知，但是可以很显而易见的推测，随着DMSO用量降低会导致细胞活率的降低。
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本专利技术的目的在于提供一种外周血单个核细胞的冻存液、冻存方法及复苏方法，可以有效的冻存细胞，在复苏后仍然具有较高的活细胞率，具有较高的应用价值，值得推广。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种外周血单个核细胞的冻存液，包括如下体积百分比的组分：优选地，由如下体积百分比的组分组成：其中，所述无血清培养基为X-VIVO15无血清培养基。其中，所述非渗透性保护剂为人白蛋白、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、海藻糖和聚乙烯比咯烷酮中的至少一种。优选地，所述非渗透性保护剂为人白蛋白。其中，所述渗透性保护剂为DMSO、甘油、丙二醇和乙二醇中的至少一种。优选地，所述渗透性保护剂为DMSO。其中，所述抗氧化物质为抗坏血酸、硫辛酸、虾青素、花青素、叶黄素和白藜芦醇中的至少一种。一种外周血单个核细胞的冻存方法，包括如下步骤：将外周血单个核细胞悬液离心后去除上清液，加入上述的外周血单个核细胞的冻存液，使细胞密度不高于2*107cells/mL，然后放置于程度降温盒内，并转移至-80℃冰箱过夜，次日移入液氮罐。一种外周血单个核细胞的复苏方法，包括如下步骤：将上述的外周血单个核细胞的冻存方法得到的冻存液置于37℃水浴溶解，然后吸取冻存细胞液转移至含有10wt％自体血浆的的X-VIVO15无血清培养基中，离心，清洗细胞，接种在X-VIVO15无血清培养基，计算细胞活率。本专利技术的有益效果在于：本专利技术采用无血清培养基+非渗透性保护剂+渗透性保护剂+抗氧化物质的冻存液组合，可以有效的冻存细胞，在复苏后仍然具有较高的活细胞率，具有较高的应用价值，值得推广。附图说明图1是实施例4的活细胞率-复苏时间的折线图。具体实施方式为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例及附图1对本专利技术作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本专利技术的限定。实施例1冻存液1冻存液由如下组分组成：500μLX-VIVO15无血清培养基，200μL人白蛋白，100μL0.5wt％透明质酸钠，100μL50μg/mL抗坏血酸，100μLDMSO。在其它的可替代的实施例中，冻存液可以由如下组分组成：400μLX-VIVO15无血清培养基，150μL人白蛋白，150μL0.5wt％透明质酸钠，150μL50μg/mL抗坏血酸，150μLDMSO组成；也可以由如下组分组成：600μLX-VIVO15无血清培养基，250μL人白蛋白，50μL0.5wt％透明质酸钠，50μL50μg/mL抗坏血酸，50μLDMSO。对比例1冻存液2冻存液由如下组分组成：500μLX-VIVO15无血清培养基，200μL人白蛋白，100μL0.2M海藻糖，100μL50μg/mL抗坏血酸，100μLDMSO。对比例2冻存液3冻存液由如下组分组成：500μLX-VIVO15无血清培养基，200μL人白蛋白，100μL0.2M海藻糖，100μL75mg/mL葡萄糖，100μLDMSO对比例3冻存液4冻存液为CorningKMBankerII即用型细胞冻存液对比例4冻存液5冻存液为BiolifeCryoStorCS10FreezeMedia对比例5冻存液6冻存液为ZenoaqSTEM-CELLBANKER○RGMPgrade实施例2PBMC分离抗凝收集外周血，离心后上层血浆，备用。按照1:1的比例，将离心管中去除血浆的组分沿着管壁逐渐加入到淋巴细胞分离液上层，离心后吸取白膜层细胞，加入X-VIVO15无血清培养基清洗3次，重悬计数。实施例3PBMC冻存将计数后的细胞悬液等分转移至15ml离心管中，离心后弃上清，转移至6个冻存管中并分别加入冻存液1-6，每个冻存管冻存1.87*107cells，冻存体积1mL。将冻存管封口，置于程度降温盒内，并迅速转移至-80℃冰箱，隔夜后将冻存管转移至-196℃的液氮罐内。实施例4PBMC复苏7d后取出冻存管，迅速置37℃水浴中轻轻晃动，当冻存管中融化至还剩少许冰块时为止，迅速吸取冻存管中的冻存细胞，置于含有10％自体血浆的X-VIVO15无血清培养基中(37℃水浴预热)，15mL离心管500g离心10分钟，清洗1次细胞，接种在X-VIVO15无血清培养基，台盼蓝染色，进行细胞计数。活细胞率(％)＝[L/(D+L)]*100％L：显微镜下观察计数板中活细胞数D：被染成蓝色的死细胞数。结果：采用6种冻存液冻存细胞，复苏后的活细胞率趋势如图1所示。我们发现采用本专利技术方法冻存PBMC，在复苏8h后本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种外周血单个核细胞的冻存液，其特征在于：包括如下体积百分比的组分：/n

【技术特征摘要】
1.一种外周血单个核细胞的冻存液，其特征在于：包括如下体积百分比的组分：





2.根据权利要求1所述的一种外周血单个核细胞的冻存液，其特征在于：由如下体积百分比的组分组成：





3.根据权利要求1所述的一种外周血单个核细胞的冻存液，其特征在于：所述无血清培养基为X-VIVO15无血清培养基。


4.根据权利要求1所述的一种外周血单个核细胞的冻存液，其特征在于：所述非渗透性保护剂为人白蛋白、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、海藻糖和聚乙烯比咯烷酮中的至少一种。


5.根据权利要求4所述的一种外周血单个核细胞的冻存液，其特征在于：所述非渗透性保护剂为人白蛋白。


6.根据权利要求1所述的一种外周血单个核细胞的冻存液，其特征在于：所述渗透性保护剂为DMSO、甘油、丙二醇和乙二醇中的至少一种。


7.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕品雷，何安涛，李莉，李相鲁，
申请(专利权)人：广东万海细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44