体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法、试剂盒以及肿瘤疫苗技术

本发明专利技术涉及一种体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法、试剂盒以及肿瘤疫苗。所述体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法，包括：S1、在外周血单个核细胞的细胞培养液中加入肿瘤新生抗原刺激并进行培养孵育；S2、采用IFNγ酶联免疫斑点法检测识别所述肿瘤新生抗原的肿瘤新生抗原特异性T细胞。实施本发明专利技术的体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法和试剂盒，通过IFNγ酶联免疫斑点法可以高精度地检测出肿瘤新生抗原特异性T细胞，且检测方法简单、结果明确、成本低廉。实施本发明专利技术的肿瘤疫苗，可以有效扩增肿瘤新生抗原特异性T细胞，进而有效用于肿瘤免疫治疗药物的制作。

Method for detecting tumor specific antigen T cell in vitro, reagent kit and tumor vaccine

The invention relates to a method for detecting tumor specific antigen T cell in vitro, a kit and a tumor vaccine. The method includes in vitro detection of tumor antigen-specific T cells: solution with tumor antigen stimulation and cultivation of incubation of S1 in peripheral blood mononuclear cells in cell culture; S2, using the IFN gamma enzyme linked immunospot assay for detection and identification of the tumor antigen of tumor specific antigen T cell. Methods and kits for carrying out the invention in vitro detection of tumor antigen-specific T cells, by IFN gamma enzyme-linked immunospot assay can accurately detected tumor antigen-specific T cells, and the detection method is simple, low cost, clear results. The tumor vaccine of the invention can effectively amplify tumor specific antigen T cells, and thus be effectively used for the production of tumor immunotherapy drugs.

【技术实现步骤摘要】
体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法、试剂盒以及肿瘤疫苗
本专利技术涉及分子免疫学和细胞免疫学领域，更具体地说，涉及一种体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法、试剂盒，以及肿瘤疫苗。
技术介绍
T细胞通过T细胞表面免疫受体特异性识别肿瘤细胞的主要组织相容性分子(Majorhistocompatibilitycomplex，MHC)递呈的抗原肽段(即抗原表位)来杀死或者杀伤癌细胞。CD8+细胞毒性T细胞(CytotoxicTlymphocytes,CTL)能特异性识别靶细胞分泌重要的细胞因子干扰素γ(Interferonγ,IFNγ)，并直接杀伤癌细胞。CD4+辅助T细胞识别肿瘤抗原表位后能分泌多种细胞因子包括IFNγ、IL2、IL4和TNFα，激活CD8+CTL识别并杀伤肿瘤细胞。目前找寻合适的肿瘤细胞特有靶点，即肿瘤抗原，以及扩增特异性识别肿瘤抗原的免疫细胞是肿瘤免疫治疗技术的关键技术。目前大部分细胞免疫治疗选择的靶点是肿瘤细胞过表达抗原，即在肿瘤细胞中的表达远远高于正常细胞。肿瘤新生抗原是区分肿瘤细胞和正常细胞的特异性靶点，是肿瘤免疫细胞治疗的最佳靶点。检测特异性识别肿瘤新生抗原的T细胞可以使用MHC-肽多聚体染色(比如ProImmune的五聚体，Beckmancoulter的四聚体以及Immundex公司的dextramer)。外周血中新生抗原特异性的T细胞能结合MHC-肿瘤新生抗原肽的多聚体，偶联在多聚体上的荧光分子在激光激活下会发出荧光，所以结合了MHC-肽多聚体的肿瘤新生抗原肽多聚体的特异性T细胞可以被细胞流式仪检测到，用来分析病人外周血中识别肿瘤新生抗原肽的T细胞数量和比率。然而，使用MHC-肽多聚体流式细胞分析方法检测肿瘤新生抗原特异性T细胞识别主要有以下几个缺点：1)不确定性高：肿瘤新生抗原的长度以及递呈它对应的MHC分子都具有不确定性，因此可能无法产生稳定的MHC-新生肽的多聚体；2)敏感度低：MHC-肽多聚体流式细胞分析方法能有效检测的特异性T细胞比率是0.001％，当低于这个数值时，将无法被检测；3)功能缺失：MHC-肽多聚体流式细胞分析方法只能展现特异性T细胞能特异性地结合MHC-肽复合体，但不能检测到T细胞识别抗原肽后是否能有效被刺激，分泌功能性细胞因子或者杀伤肿瘤细胞；4)费用高：每一个抗原肽需要由特定的MHC分子递呈而被T细胞识别，因此检测费用高。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种确定性强、敏感度高、功能全面且费用低廉的体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法和试剂盒，以及可以用于扩增肿瘤新生抗原特异性T细胞的肿瘤疫苗。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：构造一种体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法，包括：S1、在外周血单个核细胞的细胞培养液中加入肿瘤新生抗原刺激并进行培养孵育；S2、采用IFNγ酶联免疫斑点法检测识别所述肿瘤新生抗原的肿瘤新生抗原特异性T细胞。在本专利技术所述的体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法中，所述步骤S1包括：S11、采用抗原预测软件netMHC4设计所述肿瘤新生抗原；S12、在悬浮所述外周血单个核细胞的细胞培养液中加入所述肿瘤新生抗原进行预刺激并进行培养。在本专利技术所述的体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法中，所述步骤S11包括：S111、取离体肿瘤组织做基因分析，以找出非同义的基因突变位点；S112、采用抗原预测软件netMHC4基于包含所述非同义基因突变位点的抗原与相应的主要组织相容性分子的结合能力选择结合能力最好的抗原肽序列；S113、采用抗原预测软件netMHC4从所述抗原肽序列中选择出其与相应的主要组织相容性分子的结合能力明显高于其对应的非基因突变位点与相应的主要组织相容性分子的结合能力的抗原肽序列作为所述肿瘤新生抗原。在本专利技术所述的体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法中，所述肿瘤新生抗原包括序列为LSKENSLIIQFTSFVAV的抗原肽和序列为KLVVVGAAGVGKSAL的抗原肽。在本专利技术所述的体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法中，所述步骤S12包括：S121、将所述外周血单个核细胞在无血清细胞培养液中悬浮，并加入所述肿瘤新生抗原进行预刺激；S122、在常温含CO2的培养箱中进行培养。在本专利技术所述的体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法中，所述步骤S2包括S21、将预刺激后的所述外周血单个核细胞转移到包被有IFNγ抗体的容器内，加入所述肿瘤新生抗原进行孵育，从而使得受到所述肿瘤新生抗原刺激后的肿瘤新生抗原特异性T细胞分泌IFNγ；S22、所述IFNγ抗体捕获所述IFNγ，且通过酶联反应产生新生肉眼可见的免疫斑点；S23、统计所述免疫斑点的数量，以基于所述免疫斑点的数量检测所述肿瘤新生抗原特异性T细胞的数量。在本专利技术所述的体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法中，所述步骤S21进一步包括：S211、采用乙醇水溶液在常温下润湿Elispot板，随后采用PBS清洗所述Elispot板；S212、加IFNγ抗体以包被所述Elispot板，然后加板盖低温孵育过夜，随后用PBS清洗后加封闭液封闭所述IFNγ抗体未结合的位置，加板盖常温孵育；S213、调整所述无血清细胞培养液中的预刺激后的所述外周血单个核细胞的浓度后，随后加入相应的所述肿瘤新生抗原形成混合无血清细胞培养液；S214、将所述混合无血清细胞培养液加入到包被好的所述Elispot板的板孔中，加盖板在常温含CO2的培养箱中进行培养。在本专利技术所述的体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法中，所述步骤S22进一步包括：S221、弃除所述无血清细胞培养液，然后采用PBS进行清洗，随后采用清洗液进行清洗；S222、随后加入生物素偶联的IFNγ识别抗体，常温孵育；S223、采用清洗液进行清洗，然后加入偶联链酶亲和素的辣根过氧化物酶，加板盖进行常温孵育；S224、采用清洗液进行清洗，然后加入辣根过氧化物酶的底物，室温避光，然后采用清洗液充分清洗，晾干。本专利技术解决其技术问题所采用的另一技术方案是：构造一种体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的试剂盒，包括：肿瘤新生抗原、包被有IFNγ抗体的Elispot板、以及酶联反应试剂；所述肿瘤新生抗原包括序列为LSKENSLIIQFTSFVAV的抗原肽和序列为KLVVVGAAGVGKSAL的抗原肽，所述酶联反应试剂包括生物素偶联的IFNγ识别抗体、偶联链酶亲和素的辣根过氧化物酶、辣根过氧化物酶的底物，以及助剂。在本专利技术所述的体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的试剂盒中，所述助剂包括清洗液、PBS、封闭液、无血清细胞培养液。本专利技术还涉及一种肿瘤疫苗，包括用于扩增肿瘤新生抗原特异性T细胞的肿瘤新生抗原，所述肿瘤新生抗原包括序列为LSKENSLIIQFTSFVAV的抗原肽和序列为KLVVVGAAGVGKSAL的抗原肽。实施本专利技术的体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法和试剂盒，通过IFNγ酶联免疫斑点法可以高精度地检测出肿瘤新生抗原特异性T细胞，且检测方法简单、结果明确、成本低廉。实施本专利技术的肿瘤疫苗，可以有效扩增肿瘤新生抗原特异性T细胞，进而有效用于肿瘤免疫治疗药物的制作。附图说明下面将结合附图及实施例对本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法，其特征在于，包括：S1、在外周血单个核细胞的细胞培养液中加入肿瘤新生抗原刺激并进行培养孵育；S2、采用IFNγ酶联免疫斑点法检测识别所述肿瘤新生抗原的肿瘤新生抗原特异性T细胞。

【技术特征摘要】
1.一种体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法，其特征在于，包括：S1、在外周血单个核细胞的细胞培养液中加入肿瘤新生抗原刺激并进行培养孵育；S2、采用IFNγ酶联免疫斑点法检测识别所述肿瘤新生抗原的肿瘤新生抗原特异性T细胞。2.根据权利要求1所述的体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法，其特征在于，所述步骤S1包括：S11、采用抗原预测软件netMHC4设计所述肿瘤新生抗原；S12、在悬浮所述外周血单个核细胞的细胞培养液中加入所述肿瘤新生抗原进行预刺激并进行培养。3.根据权利要求2所述的体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法，其特征在于，所述步骤S11包括：S111、取离体肿瘤组织做基因分析，以找出非同义的基因突变位点；S112、采用抗原预测软件netMHC4基于包含所述非同义基因突变位点的抗原与相应的主要组织相容性分子的结合能力选择结合能力最好的抗原肽序列；S113、采用抗原预测软件netMHC4从所述抗原肽序列中选择出其与相应的主要组织相容性分子的结合能力明显高于其对应的非基因突变位点与相应的主要组织相容性分子的结合能力的抗原肽序列作为所述肿瘤新生抗原。4.根据权利要求3所述的体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法，其特征在于，所述肿瘤新生抗原包括序列为LSKENSLIIQFTSFVAV的抗原肽和序列为KLVVVGAAGVGKSAL的抗原肽。5.根据权利要求2所述的体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法，其特征在于，所述步骤S12包括：S121、将所述外周血单个核细胞在无血清细胞培养液中悬浮，并加入所述肿瘤新生抗原进行预刺激；S122、在常温含CO2的培养箱中进行培养。6.根据权利要求1-5中任一权利要求所述的体外检测肿瘤新生抗原特异性T细胞的方法，其特征在于，所述步骤S2包括S21、将预刺激后的所述外周血单个核细胞转移到包被有IFNγ抗体的容器内，加入所述肿瘤新生抗原进行孵育，从而使得受到所述肿瘤新生抗原刺激后的肿瘤新生抗原特异性T细胞分泌IFNγ；S22、所述IFNγ抗体捕获所述IFNγ，且通过酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩研妍，梁小玲，陈锡和，马民骏，唐龙清，周向军，
申请(专利权)人：恒瑞源正深圳生物科技有限公司，深圳源正细胞医疗技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44