一种抗肿瘤干细胞抗原OCT4特异性CTL及其制备方法技术

本发明专利技术采用具有定向靶向的纳米脂质体负载肿瘤干细胞抗原制备抗原特异性T淋巴细胞。本发明专利技术制备肿瘤干细胞抗原特异性T淋巴细胞技术不仅采用新型纳米脂质体负载肿瘤干细胞抗原，以肿瘤干细胞为治疗的靶目标，能够诱导更有效的靶向杀伤肿瘤干细胞的特异性细胞毒性T淋巴细胞，直接针对肿瘤发生和复发的根源，使肿瘤治疗更具有“治本”性；采用72小时快速成熟树突状细胞，大大缩短肿瘤患者最佳治疗的时间窗口；同时采用工程细胞放大扩增抗原特异性T淋巴细胞，能产生高比例的杀伤能力更强的Tcm。本发明专利技术肿瘤干细胞抗原OCT4特异性T淋巴细胞制备方法简便易行，免疫靶点针对肿瘤干细胞，抗原性强且稳定性良好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生命科学
，尤其涉及一种抗肿瘤干细胞抗原OCT4特异性CTL及其制备方法。
技术介绍
在我国，恶性肿瘤已成为危害人类健康的重要疾患之一，每年发病率为235.23/10万人，死亡率为148.81/10万。近年来随着科技，医学诊断和治疗水平的发展和提高，但肿瘤的总体死亡率和生存率仍无明显改善，复发和转移依然是导致癌症预后不佳的主要原因。随着对肿瘤生物学特性的深入研究，目前认为一些恶性实体肿瘤(脑胶质瘤、肺癌、乳腺癌和大肠癌等)是一种干细胞疾病，即肿瘤来源于肿瘤干细胞，肿瘤干细胞又称为肿瘤起始细胞。这类细胞仅占整个肿瘤细胞一小部分，但是具有自我更新能力和多向分化潜能，是形成不同分化程度的肿瘤和肿瘤不断生长的根源，可能是肿瘤治疗失败的根源。进一步研究发现，肿瘤干细胞不仅较其他肿瘤细胞更具转移潜能，而且对化疗、放射更具抗性。因此，如何杀灭整个肿瘤内的干细胞以获得肿瘤稳定而长久的退缩，甚至治愈是目前肿瘤学领域研究的热点和重点。近期有多项研究报道Oct4在多种恶性肿瘤组织或细胞系中异常表达，提示Oct4除了活跃于干细胞的生长过程，还极有可能参与成体细胞及肿瘤的发生过程，这为Oct4与恶性肿瘤的相关性研究提供了思路和方向。Oct4是Pit-Oct-Unc(POU)转录因子家族的成员之一，由POU5F1基因编码产生的，定位于6号染色体上(6p21.31)，长度为16.40kb，属于类蛋白。Oct4基因<br>就是其中一个关键基因，也被称为Oct3、POU5F1、OTF3或OTF4，是POU转录因子家族中的一员。Oct4能维持胚胎干细胞的未分化状态并促进其不断增殖，而它在肿瘤的发生、增殖及分化过程中起着一定作用。研究发现，Oct-4的异常高表达可增加干细胞转变为恶性肿瘤细胞潜能，而抑制其表达则可以抑制恶性肿瘤的发生、发展，并且Oct-4表达水平的高低和生殖系统肿瘤的恶性程度有显著的正相关性。OCT4仅在肿瘤干细胞中存在，而肿瘤干细胞是存在的极少量的具有自我更新、高致瘤力、侵袭力及耐药性的原始未分化细胞。对维持肿瘤干细胞自我更新、致瘤力、侵袭力及耐药性等特性有重要作用，靶向OCT4的治疗将为消灭肺癌干细胞提供新思路。针对肿瘤干细胞的新型疗法将与现有手术、化疗、放疗等传统方法相结合，给癌症患者带来新的希望和福音。因此，以OCT4为靶点的针对肿瘤干细胞的靶向治疗将具有重要的临床意义。一方面，可能作为临床上提供判断肿瘤预后的分子指标；另一方面，可以利用其作为分子靶基因进行抗肿瘤治疗，来克服肿瘤放化疗的抵抗性，提高肿瘤的治疗疗效。在人类抗癌历史上，与癌症抗争有过三大利器：外科手术，化疗，与放射治疗。至此，免疫科学家斯坦曼利用先前发现的树突状细胞(Dendriticcell,DC)，激发自身的免疫力清除肿瘤，利用自己的研究成果，将生命由预期的数月延长到四年。由于他对免疫领域的贡献在2011年获得诺贝尔生理医学奖，在肿瘤领域并开创了一个新的天地——肿瘤免疫细胞治疗。他的研究成果现在已经广泛应用于临床，已经成为继手术、放、化疗后的第四种癌症治疗方式。由于肿瘤免疫细胞治疗能够联合手术、化疗、放疗精准清除残余肿瘤细胞，防止复发和转移，加强免疫监视作用，提升患者生存质量和时间，并且没有放化疗的毒副作用和手术的巨大伤害。近年来，在临床应用中受到越来越广泛的关注，是国内外研究的热点，已被公认为是最具前景的肿瘤治疗方法。过继性免疫细胞治疗是指通过输入自身或同种异体的肿瘤杀伤细胞来治疗肿瘤的方法。它不仅可以纠正细胞免疫功能的低下，促进宿主抗肿瘤免疫的功能，还可以直接发挥抗肿瘤的作用。其中细胞毒性T细胞的过继治疗有着特殊的优越性。细胞毒性T细胞的过继治疗是实体肿瘤，尤其是肿瘤相关抗原比较明确的恶性黑色素瘤、结直肠癌、肝癌、前列腺癌、肺癌等的研究热点。特异性CTLs(细胞毒性T细胞)的产生是通过将肿瘤抗原负载成熟的DC(树突状细胞)刺激T细胞从而获得抗原的特异性CTL克隆。这种CTL能识别并杀伤携带相应肿瘤抗原的恶性细胞，经过大量的扩增就能应用于临床治疗。这种治疗方法相比其他的治疗方法具有易获得、可操作性强，靶向性好，安全性高等特点。但是，过继性T细胞转移还面临很多的问题：DC的成熟程度低，免疫耐受，特异性活化T细胞的数量不足等等。由于DC扩增具有很大的难度，所以这也间接限制了特异性活化T细胞的数量。以树突状细胞疫苗为代表的肿瘤免疫治疗成为继手术、化疗、和放疗后的第四种抗肿瘤疗法，主要利用肿瘤细胞的抗原物质刺激机体产生特异性肿瘤细胞免疫杀伤，从而达到消灭肿瘤的目的。与传统的抗肿瘤治疗相比，DC疫苗介导的免疫治疗具有安全性好、特异性高等诸多优点，目前已被广泛用于治疗肺癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤等各类恶性肿瘤，然而其临床疗效仍有待进一步提高。树突状细胞(DC)作为体内功能最强的抗原递呈细胞，是激发机体产生抗肿瘤免疫应答的首要核心环节。它能摄取抗原，并将抗原信息通过MHC-I类分子提呈给CD8+T淋巴细胞，能够诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)生成，继而杀死肿瘤细胞，适用于多种肿瘤的免疫疗法。因此，提高DC对抗原的摄取量和提呈能力是增强其临床疗效的重要策略。纳米级脂质体是由磷脂双层壳包裹水相核心形成的球形的实体，其结构类似生物膜,是一种生物相容性好且无毒的纳米材料。它可包封水溶性和脂溶性药物,具有减少药物剂量、缓释、及靶向性释放药物等优点，因而被广泛用于纳米级抗肿瘤药物的开发。此外，纳米级脂质体也是一种优良的抗原载体，不仅能够包裹一系列理化性质不同的抗原及免疫佐剂，保护蛋白多肽抗原不被降解，还可以促进抗原呈递细胞对抗原的吞噬及呈递，提高机体的特异性免疫反应。基于以上这些优点，纳米级脂质体作为一种新型的疫苗载体，正逐渐用于细菌疫苗、病毒疫苗、抗寄生虫疫苗以及抗肿瘤疫苗等研制开发。中性脂质体和表面携带正电荷的阳离子纳米级脂质体是最常用的纳米疫苗载体。其中特别值得关注的是阳离子纳米级脂质体，它不但是优良的蛋白/多肽抗原载体，还是一种新型的免疫佐剂，可直接活化抗原呈递细胞，增强疫苗诱导的免疫反应。目前肿瘤的细胞免疫治疗效果仍不理想，主要原因包括如下两方面：1)肿瘤患存在免疫抑制的微环境，一方面，肿瘤组织的T淋巴细胞产生免疫耐受，另一方面，肿瘤细胞能够分泌多种免疫抑制因子，诱导产生调节性T淋巴细胞或抑制DCs功能。2)肿瘤免疫治疗中应用的抗原本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗肿瘤干细胞抗原OCT4特异性CTL的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，制备包裹有肿瘤干细胞抗原OCT4的靶向树突状细胞C‑型凝集素受体的阳离子脂质体载体；步骤二，利用所述步骤一得到的阳离子脂质体载体将肿瘤干细胞抗原OCT4负载于成熟DC细胞；步骤三，利用所述步骤二得到的成熟DC细胞诱导得到OCT4特异性T淋巴细胞和中枢性记忆性T淋巴细胞。

【技术特征摘要】
1.一种抗肿瘤干细胞抗原OCT4特异性CTL的制备方法，其特征在于，包括以
下步骤：
步骤一，制备包裹有肿瘤干细胞抗原OCT4的靶向树突状细胞C-型凝集素受体
的阳离子脂质体载体；
步骤二，利用所述步骤一得到的阳离子脂质体载体将肿瘤干细胞抗原OCT4负
载于成熟DC细胞；
步骤三，利用所述步骤二得到的成熟DC细胞诱导得到OCT4特异性T淋巴细
胞和中枢性记忆性T淋巴细胞。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一中具体包括以下
步骤：
步骤1，提供聚乙二醇衍生化乙醇胺磷脂，将C-型凝集素类型的糖连接在聚乙二
醇衍生化乙醇胺磷脂，得到C-型凝集素类型的糖修饰的聚乙二醇衍生化乙醇胺
磷脂；
步骤2，将阳离子脂和步骤1中得到的C-型凝集素类型的糖修饰的聚乙二醇衍
生化乙醇胺磷脂分别溶解于氯仿和甲醇的混合溶剂中，得到混合液；
步骤3，用旋转蒸发仪将步骤2中得到的混合液旋转蒸干，使之形成一层均匀的
薄膜，真空干燥后加入含有肿瘤干细胞抗原OCT4的PBS缓冲液或纯水放置4℃
超声水化，挤压过膜后得到包裹有肿瘤干细胞抗原OCT4的靶向树突状细胞C-
型凝集素受体的阳离子脂质体载体。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二中具体包括以下
步骤：
步骤1，将外周血单个核细胞悬于基础培养基并加入DC细胞诱导培养基，种于
细胞培养板，在37℃，5％CO2，饱和湿度下培养进行DC细胞诱导；
步骤2，向DC细胞中加入适量的所述步骤一得到负载有肿瘤干细胞抗原OCT4
的阳离子脂质体载体，共孵育培养6小时；然后加入DC促成熟培养基，继续培
养24-48小时，即得...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈尚，刘根桃，李晓祥，
申请(专利权)人：深圳市中美康士生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44