一种检测肿瘤微环境相关抗原表达的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测肿瘤微环境相关抗原表达的方法，包括以下步骤：步骤一：从实体瘤组织样品中提取样品RNA；步骤二：检验样品RNA；步骤三：以提取的检验合格的样品RNA为模板，oligo dT为引物进行RNA的反转录得到组织样品cDNA；步骤四：设计qPCR检测引物，通过qPCR扩增各组织样品cDNA，采集荧光信号。本发明专利技术的有益效果：发明专利技术人选取了多种肿瘤微环境相关抗原，并相应设计了对应的多种抗原引物，通过当前主流的基因表达分析方法，荧光定量PCR法特异性的检测抗原在组织样品的表达情况，通过本方法，得到肿瘤患者的微环境相关的多种抗原表达值，当医生为患者提供具有针对性的治疗方案时，该表达值具很强的参考性。

Method for detecting expression of tumor microenvironment related antigen

The invention discloses a method for detecting the tumor microenvironment associated antigen expression, comprises the following steps: extracting RNA from tissue samples of solid tumor samples; step two: test sample RNA; step three: to sample RNA extraction test qualified as template, oligo dT as primers for reverse transcription by the organization sample cDNA RNA; step four: design qPCR primers, each tissue sample cDNA was amplified by qPCR, fluorescence signal acquisition. The invention has the advantages that the inventor selects a variety of tumor microenvironment associated antigen, and the corresponding design a variety of antigen primers corresponding to the analysis method by current gene expression, fluorescence quantitative PCR detection of antigen specificity expression in tissue samples, through this method, get cancer patients is related to several micro environment antigen expression value, when the doctors provide patients with targeted therapy, the expression has a strong reference value.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于抗原表达检测
，具体地说，涉及一种检测肿瘤微环境相关抗原表达的方法。
技术介绍
近年的研究发现各种肿瘤的微环境，尤其是实体肿瘤，对机体抗肿瘤免疫反应有着极强的抑制作用。这些抑制机制主要有以下几个方面：第一，肿瘤细胞表面表达的PD-L1/PD-L2传递抑制性信号到T淋巴细胞表面的PD-1。由于PD-1是一个抑制性受体，T淋巴细胞对瘤细胞的杀伤功能受到抑制。一年来，美国FDA连续批准了抗PD-1抗体治疗肺癌，肾癌，及抗PD-L1抗体治疗晚期膀胱癌，表明阻断肿瘤微环境对肿瘤免疫反应的抑制是非常有效的治疗手段。第二，肿瘤中侵润的抑制性细胞亚群，调节性T淋巴细胞(Treg)。Treg可以直接抑制抗肿瘤的效应T细胞，而近年的研究发现低剂量的环磷酰胺可以有效的清除体内的Treg，增强抗肿瘤特异免疫反应。第三，肿瘤细胞内表达的一些抑制性酶，包括环氧化酶cyclooxygenases(Cox1/Cox2/PGE2)，和吲哚胺2，3-双加氧酶IDO-1/IDO-2/TDO-1。这些抑制性酶对机体的抗肿瘤反应都有极强的抑制作用。针对这些抑制性酶，现有的药物如阿司匹林可以很好的抑制环氧化酶1和2的活性，预防肠癌的发生和复发。西乐葆抑制环氧化酶2的活性，在临床中与其他药物合用治疗肿瘤。需要强调的是来自不同患者的肿瘤具有非常不同的肿瘤微环境和不同的免疫抑制机制。因此，要想取得有效的治疗效果，必须对每一个患者的肿瘤微环境中的免疫抑制机制进行分析才能设计具有针对性的治疗方案。肿瘤的免疫治疗需要采用综合手段，而现有技术中的免疫治疗通常只检测少数几种肿瘤相关的抗原，无法对整个的肿瘤微环境进行全面、透彻的分析，从这样的检测结果出发，也很难找到针对性的治疗方案。
技术实现思路
针对相关技术中的上述技术问题，本专利技术提出一种检测肿瘤微环境相关抗原表达的方法，能够针对肿瘤免疫微环境相关的多种抗原，检测结果可以成为治疗肿瘤可靠的参考，可供医生结合自身的治疗经验为患者找到更加个体化的治疗方案来进行免疫干预。为实现上述技术目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种检测肿瘤微环境相关抗原表达的方法，包括以下步骤：步骤一：从实体瘤组织样品中提取样品RNA；步骤二：检验样品RNA；步骤三：以提取的检验合格的样品RNA为模板，oligodT为引物进行RNA的反转录得到组织样品cDNA；步骤四：设计qPCR检测引物，通过qPCR扩增各组织样品，采集荧光信号；其中，设计用于qPCR扩增检测引物序列为以下9组：GAPDHF：AGGTCGGAGTCAACGGATTTG；GAPDHR：GTGATGGCATGGACTGTGGT；COX1F：GGAGTTTGTCAATGCCACCT；COX1R：GCAACTGCTTCTTCCCTTTG；COX2F：ATGGAATTACCCAGTTTGTTGAATC；COX2R：TGGAAGCCTGTGATACTTTCTGTACT；PDL1F：GTGCATGATCAGCTATGGTGGTG；PDL1R：CAGTTCATGTTCAGAGGTGACTGGA；PDL2F：CTGGAATTGCAGCTTCACCAGA；PDL2R：GTTGCATTCCAGGGTCACATTG；IDO1F：AAAGGGGACCCGAGCAATG；IDO1R：CTTCCTGGTGATAGCGGTTCG；TDOF：GGGAACTACCTGCATTTGGA；TDOR：GTGCATCCGAGAAACAACCT；FOXP3F：TGACCAAGGCTTCATCTGTG；FOXP3R：AGGAACTCTGGGAATGTGCT；PGE2F：GTACTGGCTTCGTACGCGCG；PGE2R：TAGCGCTCCAGGGCCATGGC。进一步地，本专利技术还提供了一种用于步骤三的组织样品cDNA获得反应体系，共20ul，包括10XRTBuffer，2.0ul；25XdNTPMix，0.8ul；10Xoligo(dT)，2.0ul；逆转录酶，1.0ul；RNA酶抑制剂，1.0ul；样品RNA，1ug；其余部分为无核酸纯水；组织样品cDNA获得反应条件为25℃，10min；37℃，120min；85℃，5min；得到组织样品cDNA后在4℃下保存。进一步地，本专利技术还提供了一种用于步骤四的qPCR检测反应体系，共15ul，包括组织样品cDNA，2μl；正向引物，0.5ul；反向引物，0.5ul；2XTransStart@TopGreenqPCRSuperMix，7.5μl；双蒸水，4.5ul；qPCR检测反应条件为94℃，30s；94℃，5s；58℃，15s；72℃，10s；共40个循环。本专利技术的有益效果：专利技术人选取了多种肿瘤微环境相关抗原，并相应设计了对应的多种抗原引物，通过当前主流的基因表达分析方法，荧光定量PCR法特异性的检测抗原在组织样品的表达情况，通过本方法，得到肿瘤患者的微环境相关的多种抗原表达值，当医生为患者提供具有针对性的治疗方案时，该表达值具很强的参考性。附图说明图1是根据本专利技术实施例所述的一种检测肿瘤微环境相关抗原表达的方法得出的BT048病人的微环境相关抗原表达值的柱形图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，该具体实施方式应理解为是为了进一步阐明本专利技术而不用以限制本专利技术。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。实施例一：从实体瘤组织样品中提取样品RNA1.1组织样品的选取和制备：手术切下的肿瘤组织及用作阴性对照的良性肿瘤组织，切除边缘，选取中间完好的组织块在最短的时间内放置于RNAlater中在-80℃下保存，防止RNA降解；其中，RNAlater是一种液态的，无毒的组织保存试剂。它能迅速稳定组织，保护非冷冻细胞RNA于原位。获得组织块后，迅速浸泡在RNAlater中保存，而不会引起RNA的降解，这样可以不必马上处理样品或将样品冷冻在液氮之中以备以后处理，属于本领域常规试剂，可从商业途径获得。1.2取30mgRNAlater保存样品，加1mlTRIzol，充分研磨，使组织块充分裂解，按200μl/mlTRIzol的比例加入氯仿，充分震荡混匀，4℃，12000rpm离心15min；其中，TRIzol是一种总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA，属于本领域常规试剂，可从商业途径获得。1.3小心吸取上层水相于另一新的EP管中，加入等体积异丙醇，沉淀RNA，4℃，12000rpm离心10min，收集沉淀的RNA；1.4用75％乙醇洗涤沉淀得到的RNA，4℃，12000rpm离心10min；1.5重复1.4步骤；1.6弃掉乙醇，待乙醇挥发殆尽，适量DEPC水溶解组织样品RNA；其中DEPC水是用DEPC(diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的纯水，不含杂质RNA、DNA和蛋白质，通过本领域常规技术手段可得到。实施例二：检验样品RNA用超微量分光光度计准确测得组织样品RNA浓度，其中，在本实施例中所用的超微量分光光度计型号为Nanodrop2000。用生物分析仪对RNA进行质量分析，其本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测肿瘤微环境相关抗原表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：从实体瘤组织样品中提取样品RNA；步骤二：检验样品RNA；步骤三：以提取的检验合格的样品RNA为模板，oligo dT为引物进行RNA的反转录得到组织样品cDNA；步骤四：设计qPCR检测引物，通过qPCR扩增各组织样品cDNA，采集荧光信号，所述检测引物包括以下9组：GAPDHF：AGGTCGGAGTCAACGGATTTG；GAPDHR: GTGATGGCATGGACTGTGGT;COX1F:GGAGTTTGTCAATGCCACCT;COX1R:GCAACTGCTTCTTCCCTTTG;COX2F:ATGGAATTACCCAGTTTGTTGAATC;COX2R:TGGAAGCCTGTGATACTTTCTGTACT;PDL1F:GTGCATGATCAGCTATGGTGGTG；PDL1R：CAGTTCATGTTCAGAGGTGACTGGA；PDL2F：CTGGAATTGCAGCTTCACCAGA；PDL2R：GTTGCATTCCAGGGTCACATTG；IDO1F：AAAGGGGACCCGAGCAATG；IDO1R：CTTCCTGGTGATAGCGGTTCG；TDOF:GGGAACTACCTGCATTTGGA；TDOR：GTGCATCCGAGAAACAACCT；FOXP3F:TGACCAAGGCTTCATCTGTG;FOXP3R:AGGAACTCTGGGAATGTGCT;PGE2F：GTACTGGCTTCGTACGCGCG;PGE2R:TAGCGCTCCAGGGCCATGGC。...

【技术特征摘要】
1.一种检测肿瘤微环境相关抗原表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：从实体瘤组织样品中提取样品RNA；步骤二：检验样品RNA；步骤三：以提取的检验合格的样品RNA为模板，oligodT为引物进行RNA的反转录得到组织样品cDNA；步骤四：设计qPCR检测引物，通过qPCR扩增各组织样品cDNA，采集荧光信号，所述检测引物包括以下9组：GAPDHF：AGGTCGGAGTCAACGGATTTG；GAPDHR:GTGATGGCATGGACTGTGGT;COX1F:GGAGTTTGTCAATGCCACCT;COX1R:GCAACTGCTTCTTCCCTTTG;COX2F:ATGGAATTACCCAGTTTGTTGAATC;COX2R:TGGAAGCCTGTGATACTTTCTGTACT;PDL1F:GTGCATGATCAGCTATGGTGGTG；PDL1R：CAGTTCATGTTCAGAGGTGACTGGA；PDL2F：CTGGAATTGCAGCTTCACCAGA；PDL2R：GTTGCATTCCAGGGTCACATTG；IDO1F：AAAGGGGACCCGAGCAATG；IDO1R：CTTCCTGGTGATAGCGGTTCG；TDOF:GGGAACTACCTGCATTTGGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：何有文，廖化新，栗世铀，郑伟宏，肖云鹏，李军旗，王茜婷，袁晓辉，
申请(专利权)人：广州泰诺迪生物科技有限公司，珠海泰诺麦博生物技术有限公司，暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44