WU多瘤病毒重组抗原及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种WU多瘤病毒重组抗原，以及WU多瘤病毒重组抗原的制备方法，该方法包括如下步骤：将WU多瘤病毒VP2核酸片段和WU多瘤病毒STAg核酸片段链接，得VP2‑STAg核酸片段，装入PGEX‑20T质粒，得PGEX‑20T‑VP2‑STAg重组质粒然后转入大肠杆菌，并诱导其表达蛋白，蛋白纯化后即得WU多瘤病毒重组抗原。本发明专利技术制备方法制得的WU多瘤病毒重组抗原具有良好的抗原性，可用于WUPyV感染患儿抗体的检测，也可用于人群WUPyV感染的流行病学调查研究。

Recombinant antigen of WU multi tumor virus and preparation method and application thereof

The present invention provides a recombinant WU virus antigen and WU virus recombinant antigen preparation method, the method comprises the following steps: WU VP2 virus nucleic acid fragment and WU STAg virus nucleic acid fragment link, VP2 STAg nucleic acid fragment into PGEX plasmid 20T,, too PGEX 20T VP2 STAg recombinant plasmid and transformed into Escherichia coli, and induce the expression of protein, protein after purification of WU virus recombinant antigen. The recombinant antigen of WU multi tumor virus produced by the preparation method of the invention has good antigenicity, can be used for detecting the antibody of WUPyV infected children, and can also be used for epidemiological investigation of WUPyV infection among people.

【技术实现步骤摘要】
WU多瘤病毒重组抗原及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物工程
，具体地涉及WU多瘤病毒重组抗原及其制备方法和应用。
技术介绍
WU多瘤病毒(WUpolyomavirus,WUPyV)是2007年美国和澳大利亚科学家从1个3岁肺炎患儿的呼吸道标本中发现的一种新的多瘤病毒。研究发现，WUPyV广泛分布于世界各地，在人体多种组织、体液及分泌物中检测到WUPyV的存在，大量的分子生物学和有限的血清学研究结果表明，WUPyV主要经呼吸道感染婴幼儿及年幼儿童，并在部分病例引起严重下呼吸道疾病，如重症肺炎等，由于多数研究未设立无症状对照组且WUPyV感染多呈现多种病毒混合感染的模式，其与人类呼吸道感染间的确切关系有待通过进一步研究予以明确。1、WUPyV的分子生物学特点：WUPyV全基因长度为5229bp(或5228bp)，是一闭合环状双链DNA分子，GC含量39％。基因组包括一个早期编码区，编码大T抗原(LTAg)、小T抗原(STAg)，在另一条链上包括一个晚期编码区，编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3，早期编码区和晚期编码区被非编码调控区分开(见图1)。DNA的合成与转录均起始于调控区，呈相反的两个方向进行，分别控制早期和晚期基因的转录和DNA的复制。Venter等研究认为WUPyV的基因变异主要在VP1区，VP2及STAg基因较少变异，调节区末端—VP2始端(287-722nt)是WUPyV最大保守区域。本课题组在华南地区率先检出WUPyV，基因组鉴定结果表明，广东株(GenBank序列号GQ926975～926980)与Gaynor、韩国、我国浙江、北京地区检测鉴定的WUPyV株具有高度同源性。2、研究现状：迄今为止，尚未分离出完整的WUPyV颗粒，无体内外病毒繁殖的报道，也无相应的细胞系或动物模型可用，根据基因组预测的基因编码开放阅读框能否在病毒感染目标期间进行真实表达有待证实。绝大多数WUPyV从婴幼儿、低龄儿童呼吸道分泌物中检出，成人呼吸道中检出率非常低。免疫功能低下者体内WUPyV检出率不同报道不同。Neske等发现约89％健康献血人群体内存在WUPyVIgG抗体。WUPyV检测目前完全依赖分子生物学方法。WUPyV血清学研究报道较少，目前主要表达了VP1衣壳蛋白，对VP2、VP3和STAg蛋白表达的研究尚未见报道。也就是说，人类对WUPyV的认识极其有限，大多研究限于流行病学研究。已知WUPyV主要感染婴幼儿人群以及免疫功能低下人群，但是该病毒的传播途径、潜伏组织或器官、潜伏期、进入细胞的方式、人体感染病毒后的免疫反应方式、病毒的致病性以及是否象其他多瘤病毒一样引起人体肿瘤等诸多问题尚待明确，特别是其致病性，是首先需要进行明确的。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种具备高灵敏度和特异性的WU多瘤病毒重组抗原及其制备方法和应用。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种WU多瘤病毒重组抗原，包括SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。上述的WU多瘤病毒重组抗原由核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的WU多瘤病毒VP2核酸片段和核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的WU多瘤病毒STAg核酸片段表达得到。本专利技术还提供一种WU多瘤病毒重组抗原的制备方法，包括如下步骤：步骤1、将核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的WU多瘤病毒VP2核酸片段和核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的WU多瘤病毒STAg核酸片段链接，得VP2-STAg核酸片段；步骤2、将VP2-STAg核酸片段装入PGEX-20T质粒，得PGEX-20T-VP2-STAg重组质粒；步骤3、将PGEX-20T-VP2-STAg重组质粒转入大肠杆菌，并诱导PGEX-20T-VP2-STAg重组质粒表达蛋白，蛋白纯化后即得WU多瘤病毒重组抗原。本专利技术还提供所述的WU多瘤病毒重组抗原在制备预防或治疗WU多瘤病毒感染的疫苗或药物上的应用。本专利技术的有益效果在于：将WU多瘤病毒VP2核酸片段和WU多瘤病毒STAg核酸片段链接后的嵌合片段构建表达载体，表达出的重组蛋白敏感性好、特异性高，本专利技术制备方法制得的WU多瘤病毒重组抗原具有良好的抗原性，可用于WUPyV感染患儿抗体的检测，也可用于人群WUPyV感染的流行病学调查。附图说明图1为WU多瘤病毒的基因组结构模式图(Gaynor,2007)。图2为本专利技术实施例WU多瘤病毒VP2核酸片段引物所得PCR产物图谱。图3为本专利技术实施例WU多瘤病毒STAg核酸片段引物所得PCR产物图谱。图4为本专利技术实施例PGEX-20T-VP2-STAg重组质粒的鉴定图谱。图5为本专利技术实施例GST-Resin纯化柱纯化蛋白抗原SDS-PAGE、免疫印迹鉴定结果。具体实施方式为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。本专利技术最关键的构思在于：将WU多瘤病毒VP2核酸片段和WU多瘤病毒STAg核酸片段链接后的嵌合片段构建表达载体，表达出的重组蛋白敏感性好、特异性高。本专利技术提供一种WU多瘤病毒重组抗原，包括SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。上述的WU多瘤病毒重组抗原由核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的WU多瘤病毒VP2核酸片段和核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的WU多瘤病毒STAg核酸片段表达得到。本专利技术还提供一种重组载体，包含SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。本专利技术还提供一种WU多瘤病毒重组抗原的制备方法，包括如下步骤：步骤1、将核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的WU多瘤病毒VP2核酸片段和核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的WU多瘤病毒STAg核酸片段链接，得VP2-STAg核酸片段；步骤2、将VP2-STAg核酸片段装入PGEX-20T质粒，得PGEX-20T-VP2-STAg重组质粒；步骤3、将PGEX-20T-VP2-STAg重组质粒转入大肠杆菌，并诱导PGEX-20T-VP2-STAg重组质粒表达蛋白，蛋白纯化后即得WU多瘤病毒重组抗原。其中，步骤1中，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的WU多瘤病毒VP2核酸片段由碱基序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的引物组制得，核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的WU多瘤病毒STAg核酸片段由碱基序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示的引物组制得。上述方法具体包括如下步骤：步骤1、将碱基序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的引物组进行PCR反应，得WU多瘤病毒VP2核酸片段；将碱基序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的引物组进行PCR反应，得WU多瘤病毒STAg核酸片段；步骤2、利用T4DNA连接酶将步骤1所得WU多瘤病毒VP2核酸片段和WU多瘤病毒STAg核酸片段进行平端链接，链接后用碱基序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.8的引物组进行扩增，得VP2-STAg核酸片段；步骤3、VP2-STAg核酸片段和PGEX-20T质粒分别用BamHⅠ和Xbal进行双酶切，然后利用T4DNA连接酶进行连接反应，连接产物转化、筛选后得PGEX-20T-VP2-STAg重组质粒；步骤4、将PGEX-20T-VP2-ST本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种WU多瘤病毒重组抗原，其特征在于：包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种WU多瘤病毒重组抗原，其特征在于：包括SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的WU多瘤病毒重组抗原，其特征在于：由核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的核酸片段和核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的核酸片段表达得到。3.一种WU多瘤病毒重组抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、将核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的WU多瘤病毒VP2核酸片段和核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的WU多瘤病毒STAg核酸片段链接，得VP2-STAg核酸片段；步骤2、将VP2-STAg核酸片段装入PGEX-20T质粒，得PGEX-20T-VP2-STAg重组质粒；步骤3、将PGEX-20T-VP2-STAg重组质粒转入大肠杆菌，并诱导PGEX-20T-VP2-STAg重组质粒表达蛋白，蛋白纯化后即得WU多瘤病毒重组抗原。4.根据权利要求3所述的WU多瘤病毒重组抗原的制备方法，其特征在于，步骤1中，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的WU多瘤病毒VP2核酸片段由碱基序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的引物组制得，核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的WU多瘤病毒STAg核酸片段由碱基序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆学东，张银辉，何英，
申请(专利权)人：深圳市福田区人民医院，
类型：发明
国别省市：广东,44