截短的人乳头瘤病毒的L1蛋白、其类病毒颗粒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及截短的人乳头瘤病毒的L1蛋白，其类病毒颗粒，以及其制备方法和用途。具体地，本发明专利技术涉及人乳头瘤病毒HPV6型、HPV11型、HPV16型、HPV18型或HPV58型的截短型L1蛋白，其类病毒颗粒，以及其制备方法和用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及截短的人乳头瘤病毒的L1蛋白，其类病毒颗粒，以及其制备方法和用途。具体地，本专利技术涉及人乳头瘤病毒HPV6型、HPV11型、HPV16型、HPV18型或HPV58型的截短型L1蛋白，其类病毒颗粒，以及其制备方法和用途。
技术介绍
人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)是一类双链小分子DNA病毒，具有严格的种属特异性，主要感染人的皮肤和粘膜组织，引起相应部位上皮组织的增生性病变。根据核酸序列同源性，HPV可分为100多型。HPV16、18和58与宫颈癌的发生高度相关，其中HPV16是最主要的致癌因素。HPV6和11是90％以上生殖器疣和喉乳头瘤的致病因子。完整的人乳头瘤病毒颗粒由病毒基因组DNA与衣壳两部分组成。病毒基因组是双链环状DNA（约8kb），根据功能分为三个功能区:早期区，编码6个非结构蛋白(E1，E2，E4，E5，E6，E7)，所述蛋白与病毒的复制、转录和转化作用有关；晚期区，含L1和L2两个ORF，编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2两个结构蛋白，参与病毒粒子的组装;长控制区(LCR)，又称非编码区或上游调控区，不编码任何蛋白，但含有复制起点、启动子、增强子、沉默子等多种调控元件，影响病毒的复制和转录。HPV L1蛋白为人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白，分子量为55-60kDa，是HPV疫苗主要结构蛋白。在多种表达系统中表达的HPV L1蛋白无需L2蛋白辅助，即可形成在形态结构与天然病毒颗粒相似的类病毒颗粒(Virus-Like Particle,VLP)。该种类病毒颗粒保留了病毒颗粒的天然表位，具有较强的免疫原性，可诱导针对同型HPV病毒的中和杭体，是HPV预防性疫苗主要研究方向。在动物实验中，只有L1蛋白装配成的VLP诱发的抗体具有中和病毒、预防感染的能力，而变性的L1蛋白免疫后不能预防感染。现有技术中主要采用原核系统大肠杆菌和真核系统酿酒酵母来表达HPV的类病毒颗粒。但是原核系统所表达的HPV L1蛋白翻译后修饰程度低，无法自行正确折叠，大多失去其天然构象，主要以包含体形式存在。虽然通过包含体纯化，复性等步骤也可得到HPV的VLP，但是在复性过程中蛋白损失量大，用得率低，难以在大规模工业化生产中应用。酿酒酵母作为一种表达异源蛋白的宿主也有其局限性。由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维持质粒高拷贝数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。酿酒酵母分泌的蛋白质还可能会被过度糖基化修饰，这种过糖基化修饰会严重地改变蛋白质的免疫原性，降低活性，缩短在血液中滞留的时间。酿酒酵母分泌的许多蛋白质，并没有分泌到培养基中，而是以与细胞结合的方式滞留在周质空间，给大规模生产中蛋白质的纯化制造了困难。杆状病毒－昆虫细胞体系的优点在于安全性高，对外源基因克隆容量大，具有多角体启动子控制下的高效表达，翻译后加工修饰，无内毒素污染等特点，但在大规模工业化生产中存在表达量低、培养成本高的问题，使得最终产品的成本高昂，限制了其应用。因此本领域中仍然需要提高HPV L1蛋白在杆状病毒－昆虫细胞体系中的表达量，并在机体内诱发高滴度的中和抗体，进一步降低大规模生产HPV疫苗的成本。
技术实现思路
本专利技术人发现，与野生型HPV L1基因相比，密码子经优化的且去除C端核定位信号的HPV L1基因在杆状病毒－昆虫细胞体系中的表达量有明显提高；同时发现与野生型HPV L1类病毒颗粒相比，去除C端核定位信号HPV L1类病毒颗粒免疫动物后可诱导更高的针对HPV的特异性中和抗体，在此基础上完成了本专利技术。本专利技术提供一种去除C端核定位信号的HPV L1蛋白，由其组成的类病毒颗粒及含该类病毒颗粒的疫苗。本专利技术的一方面涉及HPV L1基因,包括根据昆虫细胞偏爱密码子进行优化的HPV L1基因。本专利技术一方面涉及HPV，具体而言，涉及HPV6型、HPV11型、HPV16型、HPV18型或HPV58型。本专利技术一方面涉及以下HPV L1蛋白：C端截短了9个或21个氨基酸的HPV6型L1蛋白；优选地，该截短蛋白的序列为SEQ ID NO:1或2；更优选地，该截短蛋白的序列为SEQ ID NO:2；C端截短了9个或21个氨基酸HPV11型L1蛋白；优选地，该截短蛋白的序列为SEQ ID NO:3或4；更优选地，该截短蛋白的序列为SEQ ID NO:4；C端截短了7个或22个氨基酸的HPV16L1蛋白；优选地，该截短蛋白的序列为SEQ ID NO:5或6；更优选地，该截短蛋白的序列为SEQ ID NO:6；C端截短了9个或24个氨基酸的HPV18L1蛋白；优选地，该截短蛋白的序列为SEQ ID NO:7或8；更优选地，该截短蛋白的序列为SEQ ID NO:8；或C端截短了7个或19个氨基酸的HPV58L1蛋白；优选地，该截短蛋白的序列为SEQ ID NO:9或10；更优选地，该截短蛋白的序列为SEQ ID NO:10。本专利技术一方面涉及编码C端截短的HPV L1蛋白且密码子经优化的HPV L1基因，根据昆虫细胞偏爱密码子进行优化，其中：所述C端截短的HPV L1蛋白为C端截短了9个或21个氨基酸HPV6型L1蛋白；优选地，所述HPV L1基因的序列为SEQ ID NO:11或12；更优选地，所述HPV L1基因的序列为SEQ ID NO:12；所述C端截短的HPV L1蛋白为C端截短了9个或21个氨基酸HPV11型L1蛋白；优选地，所述HPV L1基因的序列为SEQ ID NO:13或14；更优选地，所述HPV L1基因的序列为SEQ ID NO:14；所述C端截短的HPV L1蛋白为C端截短了7个或22个氨基酸的HPV16L1蛋白；优选地，所述HPV L1基因的序列为SEQ ID NO:15或16；更优选地，所述HPV L1基因的序列为SEQ ID NO:16；所述C端截短的HPV L1蛋白为C端截短了9个或24个氨基酸的HPV18L1蛋白；优选地，所述HPV L1基因的序列为SEQ ID NO:17或18；更优选地，所述HPV L1基因的序列为SEQ ID NO:18；或所述C端截短的HPV L1蛋白为C端截短了7个或19个氨基酸的H本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种部分去除C端核定位信号的人乳头瘤病毒L1蛋白，其中所述人乳头瘤病毒为HPV6型、HPV11型、HPV16型、HPV18型或HPV58型，所述L1蛋白选自：C端截短了9个、21个氨基酸的HPV6型L1蛋白；优选该截短蛋白具有SEQ ID NO:1、2；优选SEQ ID NO:2；C端截短了9个、21个氨基酸的HPV11型L1蛋白；优选该截短蛋白具有SEQ ID NO:3、4；优选SEQ ID NO:4；C端截短了7个、22个氨基酸的HPV16L1蛋白；优选该截短蛋白具有SEQ ID NO:5、6；优选SEQ ID NO:6；C端截短了9个、24个氨基酸的HPV18L1蛋白；优选该截短蛋白具有SEQ ID NO:7、8；优选SEQ ID NO:8；C端截短了7个、19个氨基酸的HPV58L1蛋白；优选该截短蛋白具有SEQ ID NO:9、10；优选SEQ ID NO:10。

【技术特征摘要】
1.一种部分去除C端核定位信号的人乳头瘤病毒L1蛋白，其中
所述人乳头瘤病毒为HPV6型、HPV11型、HPV16型、HPV18型
或HPV58型，所述L1蛋白选自：
C端截短了9个、21个氨基酸的HPV6型L1蛋白；优选该截短
蛋白具有SEQ ID NO:1、2；优选SEQ ID NO:2；
C端截短了9个、21个氨基酸的HPV11型L1蛋白；优选该截短
蛋白具有SEQ ID NO:3、4；优选SEQ ID NO:4；
C端截短了7个、22个氨基酸的HPV16L1蛋白；优选该截短蛋
白具有SEQ ID NO:5、6；优选SEQ ID NO:6；
C端截短了9个、24个氨基酸的HPV18L1蛋白；优选该截短蛋
白具有SEQ ID NO:7、8；优选SEQ ID NO:8；
C端截短了7个、19个氨基酸的HPV58L1蛋白；优选该截短蛋
白具有SEQ ID NO:9、10；优选SEQ ID NO:10。
2.一种编码权利要求1所述的HPV L1蛋白的多核苷酸序列，优
选地，所述多核苷酸序列是经密码子优化设计的；更优选地，所述多
核苷酸序列是按照昆虫细胞使用的密码子优化设计的；优选地，其中：
所述HPV L1基因的序列为SEQ ID NO:11或12；更优选地，
所述HPV L1基因的序列为SEQ ID NO:12；
所述HPV L1基因的序列为SEQ ID NO:13或14；更优选地，
所述HPV L1基因的序列为SEQ ID NO:14；
所述HPV L1基因的序列为SEQ ID NO:15或16；更优选地，
所述HPV L1基因的序列为SEQ ID NO:16；
所述HPV L1基因的序列为SEQ ID NO:17或18；更优选地，
所述HPV L1基因的序列为SEQ ID NO:18；或
所述HPV L1基因的序列为SEQ ID NO:19或20；更优选地，
所述HPV L1基因的序列为SEQ ID NO:20。
3.一种包含权利要求2所述的多核苷酸的载体。
4.一种包含权利要求3所述的载体的细胞，优选地，所述细胞为
昆虫细胞；更优选地，所述细胞选自sf9、sf21、HighFive昆虫细胞。
5.一种组合物，包含权利要求1所述的L1蛋白；或者权利要求2
所述的多核苷酸；或者权利要求3所述的载体；或者权利要求4所述

\t的细胞。
6.一种人乳头瘤病毒类病毒颗粒，其包含权利要求1所述的L1
蛋白。
7.一种获得权利要求6所述的类病毒颗粒的方法，包括在杆状病
毒－昆虫细胞中表达权利要求2所述的多核苷酸序列，然后将含有所
述截短的L1蛋白的裂解上清进行纯化处理。
8.一种HPV疫...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔维，姜春来，孙博，徐菲，宋海鹏，张喆，
申请(专利权)人：长春百克生物科技股份公司，吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22