33型重组人乳头瘤病毒病毒样颗粒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及33型重组人乳头瘤病毒病毒样颗粒及其制备方法，具体技术要点是提供一种新的编码重组的HPV33 L1蛋白的多核苷酸基因片段、包含该基因片段的载体、包括载体的宿主细胞，以及由该基因片段翻译表达的HPV33 L1溶合蛋白、五聚体和由该五聚体组成VLP，本发明专利技术还公开该五聚体、VLP蛋白及其组成的疫苗组合物在制备预防HPV33感染的药物中的应用。

Recombinant human papilloma virus like particles of type 33 and preparation method thereof

The present invention relates to recombinant human papillomavirus type 33 virus like particles and its preparation method, specific technical points are polynucleotide gene fragment, provide a new encoding recombinant HPV33 L1 protein contains vector, the gene fragment of host cell comprises a carrier, and the gene expression of HPV33 soluble L1 translation protein, five dimers and the dimers composed of five VLP, the invention also discloses the five poly vaccine composition body, VLP protein and its components in the preparation of the prophylactic application of HPV33 infection in the.

【技术实现步骤摘要】
33型重组人乳头瘤病毒病毒样颗粒及其制备方法
本专利技术涉及人乳头瘤病毒的病毒样颗粒及其制备方法。更具体而言，本专利技术涉及一种重组的人乳头瘤病毒L1蛋白的五聚体及病毒样颗粒（Virus-likeParticle，VLP）及其制备方法，及含该病毒样颗粒的疫苗组合物在预防人乳头瘤病毒感染中的应用。
技术介绍
人乳头瘤病毒(HumanPapillomavirus，简称HPV)主要通过人体密切接触，如性传播的病毒，可引起人类多种增殖性上皮病变，包括乳头状瘤（疣）和瘤样病变。具体来讲，HPV诱发的疾病主要包括3大类，第1类：宫颈、阴道、女性外阴、阴茎和肛门的癌症及某些类型的头颈部肿瘤等恶性病变。100%的宫颈癌患者都是HPV感染所导致的，90%的肛门癌，40%的外阴、阴道及阴茎，12%的口咽及3%的口腔癌症归因于HPV感染。第2类：良性病变如扁平疣、尖锐湿疣等生殖器疣，是一种性传播疾病，在性行为活跃的人群中很常见。虽然生殖器疣不会像癌症一样造成严重的后果，但是病变通常会引起病人较为痛苦的临床症状如灼痛、出血和疼痛，同时产生尴尬、焦虑和自卑等负面的心理反应，而且反复治疗的过程浪费了大量的医疗资源。在世界范围内估计由非致癌性HPV(主要是6和11型)引起的生殖器疣有3000万，其中20～50%的病变中还包含有高危型HPV的混合感染。第3类：HPV感染还能引起复发性呼吸道乳头瘤(RRP)，这是一种罕见的、具有潜在致命性的疾病，主要发生在青少年时期，有时，大量的乳头瘤可以引起呼吸困难并导致较小年龄儿童死亡。所以预防或治疗HPV感染对人类健康意义十分重大。HPV是无囊膜的双链DNA病毒，主要由病毒外壳和基因组DNA组成(Bernard，Burketal.2011)。HPV病毒外壳是由360个L1蛋白质（形成72个五聚体）和至多72个L2蛋白质构成的二十面体结构，直径55～60nm(HowleyandLowy2007)。病毒外壳蛋白质具有自组装特性，在体外L1蛋白质单独或与L2蛋白质共同自组装形成病毒样样颗粒（Virus-likeParticle，VLP）(Chen，Garceaetal.2000，Finnen，Ericksonetal.2003，Buck，Chengetal.2008，WangandRoden2013)。由于HPV不能在体外细胞培养，要获得该病毒的特异性抗原，只能用重组DNA技术的方法制备基因工程疫苗。重组Ll或L1/L2组装形成的病毒样颗粒VLPs，无病毒DNA，安全性好，具有和天然病毒颗粒相似的抗原表位，刺激机体后可产生中和抗体IgG和IgA，因此HPVVLPs可作为预防性疫苗，从而大大降低因感染HPV导致产生相关肿瘤的可能性(HowleyandLowy2007)。HPV疫苗研制的关键是能够大量制备高纯度、稳定的HPV抗原。在HPV疫苗抗原制备技术方面，目前较为常用的生产HPV抗原的表达系统可以分为真核表达系统及原核表达系统。常用的真核表达系统有痘病毒表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、酵母表达系统。在真核表达系统中所表达的HPVL1能自发的形成VLP，往往只需进行简单的纯化即可获得VLP。但是由于真核表达系统的表达量低，培养成本高，给大规模工业化生产带来了极大困难。原核表达系统中利用大肠杆菌表达系统表达HPVL1蛋白质已有报道。但是由于大肠杆菌所表达的HPVL1蛋白质可溶性低，目前已知的纯化方法大多通过无盐沉淀或变性复性等步骤从蛋白质种类繁杂的细胞液中最终纯化得到HPVVLP。例如：在专利CN02129070.9中公开通过原核细胞表达和制备HPVL1多聚体的方法，其中纯化工艺包括通过3.3M尿素处理和透析复性过程；在WO-0204007专利中对L1-GST融合蛋白质的纯化方法也是通过尿素变性处理并进行透析复性；在现有技术中也有公开L1蛋白质的纯化方法是包括磷酸缓冲液超滤透析和离心，使目的蛋白沉淀再复溶的步骤。但是在这些纯化过程中蛋白质损失量大，得率低，难以在大规模生产上应用。在HPV疫苗抗原蛋白质VLP的均一性方面，现有技术中所组装的HPVL1VLP的粒径分散度有使用polyd值表示，polyd值<15%说明颗粒有很好的均一性，15%到30%之间说明颗粒有较大的不均一性，大于30%说明颗粒完全不够均一。现有技术中制备的HPVL1VLP多大于15%。另一个说明粒径均一的指标是PdI值，PdI值为粒径分布系数，小于0.05为高度均一的样品；0.05～0.1为准均一的样品，0.1～0.3为均一性较差的样品，大于0.3为不均一的样品。在US7205125B2专利中公开两个型别HPVL1VLP的混合蛋白液的PdI为0.07。因此，本领域仍然需要成本低、纯度高、产量高、质量稳定的HPVL1蛋白质生产技术和大规模工业化生产重组HPVL1VLP的新方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是公开一种优化的编码HPV33L1蛋白质的核苷酸序列，包含该核苷酸序列的载体、包括载体的宿主细胞，以及由该多核苷酸序列翻译表达的HPVL1蛋白质，Tag-HPV-L1重组蛋白，由该L1蛋白质形成的五聚体和VLP，以及由该五聚体和VLP作为抗原组成的预防HPV感染的疫苗。本专利技术第一方面提供一种经密码子优化的HPV33L1的基因，其核苷酸序列为SEQNO：2。本专利技术第二方面提供一种构建的表达载体，其包含本专利技术第一方面的经密码子优化的HPV33L1的基因。所述载体适合驱动异源DNA在细菌中翻译表达HPVL1蛋白质。在一个实施方案中，所述表达载体优选pGEX-6p-1、pGEX-4T-2、pMAL或pET28a。本专利技术的第三方面提供一种构建的工程菌细胞，该细胞包含本专利技术第一方面的基因，或第二方面的表达载体。所述的工程菌宿主细胞是大肠杆菌，在一个实施方案中，所述宿主细胞优选BL21细胞株。本专利技术第四方面提供一种Tag-HPV33L1融合蛋白，其中标签Tag为6*His.Tag，GST.Tag，SUMO.Tag，MBP.Tag，6*His-SUMO.Tag或GST-SUMO.Tag；L1为HPV33L1全长蛋白质和/或C端截短5个、10个、15个或不多于30个氨基酸和/或N端截短2个、4个、6个或不多于10个氨基酸的L1蛋白质。编码Tag-HPVL1融合蛋白GST-HPV33L1的核苷酸序列为SEQNO：3、SEQNO：11，，GST-SUMO-HPV33L1的核苷酸序列为SEQNO：4、SEQNO：12，MBP的核苷酸序列SEQNO：5、SEQNO：13，6*His-HPV33L1的核苷酸序列为SEQNO：6，6*His-SUMO-HPV33L1的核苷酸序列为SEQNO：7。编码Tag-HPVL1融合蛋白GST-HPV33L1的氨基酸序列为SEQNO：8，GST-SUMO-HPV33L1的氨基酸序列为SEQNO：9，MBP的氨基酸序列SEQNO：10。本专利技术第五方面提供Tag-HPVL1融合蛋白质经过纯化后获得的HPVL1的五聚体，及由五聚体组装的VLP。在一个优选实施例中HPV33L1五聚体蛋白平均粒径10～15nmPdI<0.1。在一个优选实施例中HPV33L1VLP的平均粒径45～65nmPdI<0.1。本专利技术第六方面提供了本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经大肠杆菌偏好密码子优化的编码人乳头瘤病毒HPV33 L1的基因，该基因为SEQ NO.2所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种经大肠杆菌偏好密码子优化的编码人乳头瘤病毒HPV33L1的基因，该基因为SEQNO.2所示的核苷酸序列。2.一种大肠杆菌表达载体，其特征在于该载体包括具有权利要求1所述基因的序列。3.如权利要求2所述的大肠杆菌表达载体，其特征在于该载体为pGEX-6p-1、pGEX-4T-2、pMAL或pET28a。4.一种工程菌细胞，该细胞包含权利要求1所述的基因，或权利要求2、3所述的表达载体。5.一种Tag-HPV33L1的融合蛋白，其特征在于该蛋白包括编码人乳头瘤病毒HPV33L1的基因，优选经大肠杆菌偏好密码子优化的编码人乳头瘤病毒HPV33L1的基因，更优选如权利要求1所述的基因编码；标签Tag为GST.Tag，MBP.Tag，GST-SUMO.Tag，6*His.Tag或6*His-SUMO.Tag。6.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于L1蛋白质为全长蛋白质或C端截短不多于30个氨基酸和/或N端截短不多于10个氨基酸的L1蛋白质。7.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于其核苷酸序列为SEQNO.3，SEQNO.4，SEQNO.5，SEQNO.6，SEQNO.7，SEQNO.11，SEQNO.12或SEQNO.13。8.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于其氨基酸序列为SEQNO.8，SEQNO.9或SEQNO.10。9.一种HPV33L1五聚体蛋白质，其特征在于该五聚体蛋白质由如权利要求5、6、7或8所述的融合蛋白质经过纯化后获得，五聚体蛋白平均粒径10～15nmPdI<0.1。10.一种HPV33L1的VLP，其特征在于该VLP由权利要求9所述的五聚体蛋白质组装而成，平均粒径45～65nmPdI<0.1。11.一种HPVL1蛋白质疫苗组合物，其特征在于该疫苗组合物包括权利要求9所述的HPVL1五聚体蛋白质和药用佐剂。12.一种HPVL1蛋白质疫苗组合物，其特征在于该疫苗组...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘永江，伍树明，高文双，陈晓，任永峰，王雅君，姜绪林，张瑞霞，高俊，张海江，陈建平，银飞，徐岚，仉春艳，夏丽，
申请(专利权)人：北京康乐卫士生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11