一种检测B、E型人腺病毒核酸的试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测B、E型人腺病毒核酸的试剂盒及其检测方法。所述试剂盒包括：RPA冻干颗粒，RPA反应引物，RPA反应探针，RPA缓冲液，镁盐溶液，横向流动试纸条，缓冲液，双蒸水和腺病毒基因组DNA。本发明专利技术利用横向流动试纸条对RPA核酸扩增产物进行可视化定性检测，整个反应在38℃恒温条件下进行，5-20分钟内即可通过肉眼观察试纸条上条带，判读结果，检测过程无需特殊检测仪器。本发明专利技术所述试剂盒具有灵敏度高，特异性强，操作简便，反应快速，仪器设备便携等特点，非常适合应用于腺病毒的床旁快速诊断及防疫疾控。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种病毒核酸检测试剂盒，特别涉及一种检测B、E型人腺病毒核酸的试剂盒及其检测方法。
技术介绍
人腺病毒是一类无包膜的双链DNA病毒,分为A-G7个血清学组,现已发现60多个血清型，HAdV感染人体可引发急性腺病毒型肺炎、急性胃肠炎、眼角膜炎、乳糜泻和急性间质性肾炎等多种疾病。腺病毒作为普通的机会性病原体长期存在于人群中，在居住密集的人群,如军队、学校人员中都可引起暴发流行。不同的腺病毒亚种会引起不同的疾病，C亚种主要引起小儿科的上呼吸道感染，人腺病毒F亚种会引起感染性腹泻，B亚种和E亚种可长引起成人急性发热性呼吸道疾病，在成人特别是学校和军队特殊人群中引起日益频繁的急性呼吸道传染病流行,由于传染性强且症状较重，严重者可引起死亡，因而引起人们广泛关注。腺病毒主要通过呼吸道和消化道传播，具有较高传染性，因此快速、准确的检测技术对预防和控制腺病毒的传播有重要意义。目前，检测方法大体概括可分为两类免疫学方法和分子生物学方法。前者主要包括ELISA技术。但是此技术存在一定的局限性即免疫检测法实效性低，在感染初期抗体未形成时无法准确检测。分子生物学方法主要为PCR技术。但是PCR技术对仪器及实验室的要求高，这些局限性使其应用大多限制于条件优良的实验室内，无法作为便携式仪器应用于现场防疫检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对目前腺病毒诊断技术存在的缺陷，提供一种新型的r>基于RPA-LFD技术的检测B、E型人腺病毒核酸的试剂盒及其检测方法。一种检测B、E两型人腺病毒核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：RPA冻干颗粒，RPA反应引物，RPA反应探针，RPA缓冲液，镁盐溶液，横向流动试纸条，缓冲液，双蒸水和腺病毒基因组DNA。所述RPA反应引物的序列如序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。所述RPA反应探针的序列如序列表SEQIDNo.3所示。所述RPA冻干颗粒包括噬菌体重组酶UvsX，辅助因子UvsY，DNA聚合酶，单链DNA结合蛋白和dNTPs。所述镁盐溶液为醋酸镁溶液。序列表中SEQIDNo.2所示的引物的5’端用生物素标记。所述RPA反应探针中，5’端用FAM标记，32位碱基用一个四氢呋喃碱基隔开。所述横向流动试纸条前端包被有带FAM抗体的纳米金粒，检测线上包被有生物素抗体，质控线上包被有固定抗体。一种非医疗目的的检测B、E两型人腺病毒核酸的方法，按照如下步骤进行：(1)反应体系：在RPA冻干颗粒中加入25-30μL反应缓冲液，2.0-2.3μL10μM序列表SEQIDNo.1所示的引物，2.0-2.310μM序列表SEQIDNo.2所示的引物，0.6-1μL10μMRPA反应探针，1-3μL乙型脑炎病毒基因组DNA，10.2-12.2μL双蒸水，在反应管盖上加醋酸镁溶液2.5μL，盖严管盖并离心，使醋酸镁与溶液混合，上下颠倒反应管使之充分混匀后再次离心；(2)反应过程：利用带生物素标记的引物和FAM标记的RPA反应探针与靶核酸进行扩增反应，使最终扩增产物同时携带FAM和生物素标记，横向流动试纸条前端包被有带FAM抗体的纳米金粒，检测线上包被有生物素抗体，当反应液进入试纸条时，带有FAM和生物素的扩增产物就会通过抗原抗体结合作用，在检测线上形成生物素抗体-核酸-纳米金粒复合体并显色，横向流动试纸条上还有一条质控线，包被有固定抗体，直接与带FAM抗体的纳米金粒结合，在质控线上显色；(3)结果判定：待测样品中含有B、E型人腺病毒核酸的，试纸条可见两条线；不含腺病毒核酸的，试纸条上只可见一条质控线。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术利用横向流动试纸条对RPA核酸扩增产物进行可视化定性检测，整个反应在38℃恒温条件下进行，5-20分钟内即可通过肉眼观察试纸条上条带，判读结果，检测过程无需特殊检测仪器。本专利技术所述试剂盒具有灵敏度高，特异性强，操作简便，反应快速，仪器设备便携等特点，非常适合应用于腺病毒的床旁快速诊断及防疫疾控。附图说明图1是应用本专利技术的方法对B-7,14,55三型腺病毒及无感染患者进行检测的结果图；图中，1-2，B-7型腺病毒标本；3-4，B-14型腺病毒标本；5-6，B-55型腺病毒标本；7-10，无腺病毒感染标本；11，双蒸水。图2是应用本专利技术的方法对B-7,14,55型人腺病毒、乙脑病毒、血吸虫及大肠杆菌进行检测的结果图；图中，1，B-7型腺病毒标本；2，B-14型腺病毒标本；3，B-55型腺病毒标本；4，血吸虫核酸；5，乙型脑炎病毒核酸；6，大肠杆菌核酸；7，双蒸水。具体实施方式下面结合附图，对本专利技术的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例1实验材料：RPA冻干试剂、缓冲液及镁盐溶液购自TwistDX公司TwistAmpTM试剂盒；横向流动试纸条及其缓冲液购自MileniaBiotec公司HybriDetectMGHD1试剂盒。实验原理：利用带生物素标记的引物和FAM标记的探针与靶核酸进行扩增反应，使最终扩增产物同时携带FAM和生物素标记。LFD试纸条前端包被有带FAM抗体的纳米金粒，检测线上包被有生物素抗体，当反应液进入试纸条时，带有FAM和生物素的扩增产物就会通过抗原抗体结合作用，在检测线上形成生物素抗体-核酸-纳米金粒复合体并显色。横向流动试纸条上还有一条质控线，包被有固定抗体，可以直接与带FAM抗体的纳米金粒结合，在质控线上显色，以确保试纸条的有效性。引物设计：从Genebank下载B、E型人腺病毒编码六邻体蛋白的基因序列，应用软件进行序列比对后选择较保守段，并设计合成具有如下序列的RPA-LFD引物。primerA：CATGCACATCGCCGGACAGGATGCTTCGGA(SEQIDNo.1)；primerB：5’-/biotion/-TTTGTAAGAGTATGTATTGTCCTCCCGGTC(SEQIDNo.2)；探针设计：5’-/FAM/-TAGAAACCCCACAGTAGCGCCCACCCACGAT/THF/TGACCACCGACCGTAGC/C3-spacer/-3’。5’端用FAM标记，32位的碱基用四氢呋喃(THF)替代。引物及探针均由上海生工生物工程有限公司合成。反应体系建立：1)在RPA冻干试剂中加入25-30μL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测B、E两型人腺病毒核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：RPA冻干颗粒，RPA反应引物，RPA反应探针，RPA缓冲液，镁盐溶液，横向流动试纸条，缓冲液，双蒸水和腺病毒基因组DNA。

【技术特征摘要】
1.一种检测B、E两型人腺病毒核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂
盒包括：RPA冻干颗粒，RPA反应引物，RPA反应探针，RPA缓冲液，镁盐溶
液，横向流动试纸条，缓冲液，双蒸水和腺病毒基因组DNA。
2.根据权利要求1所述的检测B、E两型人腺病毒核酸的试剂盒，其特
征在于，所述RPA反应引物的序列如序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所
示。
3.根据权利要求1所述的检测B、E两型人腺病毒核酸的试剂盒，其特
征在于，所述RPA反应探针的序列如序列表SEQIDNo.3所示。
4.根据权利要求1所述的检测B、E两型人腺病毒核酸的试剂盒，其特
征在于，所述RPA冻干颗粒包括噬菌体重组酶UvsX，辅助因子UvsY，DNA聚
合酶，单链DNA结合蛋白和dNTPs。
5.根据权利要求1所述的检测B、E两型人腺病毒核酸的试剂盒，其特
征在于，所述镁盐溶液为醋酸镁溶液。
6.根据权利要求1所述的检测B、E两型人腺病毒核酸的试剂盒，其特
征在于，序列表中SEQIDNo.2所示的引物的5’端用生物素标记。
7.根据权利要求1所述的检测B、E两型人腺病毒核酸的试剂盒，其特
征在于，所述RPA反应探针中，5’端用FAM标记，32位碱基用一个四氢呋喃
碱基隔开。
8.根据权利要求1所述的检测B、E两型人腺病毒核酸的试剂盒，其特

\t征在于，所述横...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐东刚，邢微微，孙魁，付文亮，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11