一种特异性核酸适配体及应用制造技术

本发明专利技术提供了特异性核酸适配体，其核苷酸序列为序列表<400>1所示序列，所述核酸适配体利用全菌消减SELEX技术筛选而得，分子量较小，易于合成与修饰，能够高特异性识别并且高亲和力结合肠出血性大肠杆菌O157:H7，与其他细菌并不发生特性结合，可用于检测肠出血性大肠杆菌O157:H7，对于有效地预防及控制大肠杆菌O157:H7感染具有重要意义。

Specific nucleic acid aptamer and application thereof

The present invention provides specific aptamers, their nucleotide sequence list < 400> 1 is shown in sequence, the aptamer using whole cell subtractive screening and SELEX technology, small molecular weight, easy synthesis and modification, high specific recognition and high affinity binding of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 does not occur with other bacteria, combined with the characteristics, can be used for detection of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7, for the effective prevention and control of Escherichia coli O157:H7 infection has important significance.

【技术实现步骤摘要】
一种特异性核酸适配体及应用
本专利技术涉及生物
，尤其是一种特异性核酸适配体及应用。
技术介绍
肠出血性大肠杆菌O157∶H7(EnterohemorrhagicEscherichiacoli，EHEC是一种有鞭毛、无芽孢、可运动的革兰氏阴性菌，它是肠出血性大肠杆菌的一个主要菌型。自1982年首次在美国被确认并分离以来，在世界范围内引起广泛传播。大肠杆菌O157:H7主要可引起人类腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合征以及血栓形成性血小板减少性紫癜等，死亡率高达30％。大肠杆菌O157:H7在自然界中分别较广，感染后致病力较强，仅数十个活菌就可引发胃肠道感染。在我国，大肠杆菌O157:H7是现有的对国民健康造成重大威胁的致病原之一。因此、高效、快速、灵敏地检测大肠杆菌O157:H7的方法是亟待需要的。传统的大肠杆菌O157∶H7检测方法主要包括选择性培养基分离培养法，生化方法等，这些方法大多操作步骤繁琐，且耗时较长。随着科学技术的发展，出现了一些新兴检测方法,如以PCR为基础的分子生物学法,免疫学方法，流式细胞仪法及基因芯片法等，这些方法同样也存在着仪器昂贵，操作复杂，费时等缺点。核酸适配体是通过指数级富集配体的系统进化技术(Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，SELEX)，从体外人工合成的核酸文库中筛选得到的高亲和力、高特异性结合靶分子的单链寡核苷酸，包括ssDNA、RNA和修饰RNA。适配体因其单链结构，可以形成丰富的自适应的三维空间结构与靶分子结合，扩大了靶分子的范围。此外，核酸适配体还具有稳定性好、易于修饰和保存、无免疫原性的特点。结合适配体的优点，在众多的检测领域中，适配体作为一种新型的识别元件已经成为高效、快速检测技术研究的焦点。因此，筛选大肠杆菌O157:H7的特异性核酸适配体并且建立基于适配体的大肠杆菌O157:H7的快速检测技术具有重要的应用价值。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种特异性核酸适配体，能够特异性结合大肠杆菌O157:H7。本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述特异性核酸适配体的应用。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：一种特异性核酸适配体，能够与肠出血性大肠杆菌O157:H7特异性结合，所述核酸适配体(A46)的核苷酸序列为序列表<400>1所示序列。优选的，上述核酸适配体A46，所述的核酸适配体为人工合成或PCR扩增或切胶回收单链DNA纯化后获得，该核酸适配体为单链DNA，由88个核苷酸组成，其一级结构为直链状；二级结构为茎环，最小自由能为11.96kcal/mol。优选的，上述核酸适配体(A46)，可用修饰材料对所述核酸适配体A46进行修饰，所述修饰材料为功能基团、纳米材料和/或蛋白类材料。上述核酸适配体(A46)在制备对肠出血性大肠杆菌O157:H7定性和定量检测试剂中的应用，例如，可广泛应用于荧光检测方法、酶联免疫方法以及生物传感器中。优选的，上述核酸适配体(A46)的应用，所述肠出血性大肠杆菌O157:H7为纯标本或食物中肠出血性大肠杆菌。本专利技术的有益效果是：所述核酸适配体利用全菌消减SELEX技术筛选而得，分子量较小，易于合成与修饰，能够高特异性识别并且高亲和力结合肠出血性大肠杆菌O157:H7，与其他细菌并不发生特性结合，可用于检测肠出血性大肠杆菌O157:H7，对于有效地预防及控制大肠杆菌O157:H7感染具有重要意义。附图说明图1为荧光结合率实验监测适配体筛选过程中每一轮文库与肠出血性大肠杆菌O157:H7结合效率图。图2为肠出血性大肠杆菌O157:H7核酸适配体的二级结构预测图。图3为肠出血性大肠杆菌O157:H7与其核酸适配体的解离常数拟合曲线图。图4为荧光化学分析法检测肠出血性大肠杆菌O157:H7适配体的特异性图。图5为流式细胞术检测肠出血性大肠杆菌O157:H7适配体的特异性图。图6为激光共聚焦显微镜方法检测检测肠出血性大肠杆菌O157:H7适配体的特异性图，对于激光共聚焦显微镜下观察适配体A46特异性结果分析(a～e)中，L-代表白光激发；F-代表荧光激发；M-代表白光与荧光激发重叠结果。图7为基于适配体构建的纳米磁珠-适配体荧光检测方法的标准曲线图。具体实施方式为了使本领域的技术人员更好的理解本专利技术的技术方案，下面结合附图和具体实施例对本专利技术所述技术方案作进一步的详细说明。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂、耗材如无特殊说明均未常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。实施例1全菌消减SELEX技术筛选与肠出血性大肠杆菌O157:H7特异结合的核酸适配体(1)随机单链DNA(ssDNA)文库以及引物的合成随机ssDNA文库参考相关文献如下：5’-GCAATGGTACGGTACTTCC-N45-CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’，中间随机区域为45个核苷酸，两端为固定区域，序列总长为88个核苷酸，库容量为445。筛选所用的引物序列分别为：PrimerⅠ：5’-GCAATGGTACGGTACTTCC-3’PrimerⅡ：5’-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3’PrimerⅢ：5’-GCTAAGCGGGTGGGACTTCCTAGTCCCACCCGCTTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3’其中PrimerⅠ在次级文库的制备过程中需要FITC荧光基团进行修饰。在构建的荧光检测方法中适配体A46需要进行生物素修饰。上述的核酸序列均由上海生工生物有限公司完成。(2)筛选所用菌株及其培养与收集上述全部菌株均由军事医学科学院卫生学环境医学研究所提供。实验选取的靶细菌为E.coliO157:H7(CICC21530)；选取的消减细菌为大肠杆菌(ATCC25922)，志贺氏菌(CICC21534)，沙门氏菌(CMCC50115)。具体操作方法如下：首先将超净工作台紫外照射灭菌30min，接种过程进行无菌操作，分别将4株保存的菌种各取50μl接种到四支高温高压灭菌的LB肉汤培养基中，于37℃恒温摇床培养箱中培养至菌液浓度107cfu/ml。分别取4个高温高压灭菌的1.5ml离心管，做相应的标记；在无菌环境下，用移液器各取出1ml菌液加入到相应的离心管中，5000r/min离心5min，弃掉上清培养基，用1×PBS缓冲液将菌体沉淀重悬，再次5000r/min离心5min。使用PBS缓冲液洗涤3次，最后将菌体沉淀使用100μlPBS缓冲液重悬，保存于4℃备用。(3)消减SELEX筛选过程首轮筛选的方法是：1)将体外人工合成的1.5nmol的ssDNA文库溶解于100μl结合缓冲液中，于95℃热变性10min后迅速置于冰上至充分冷却；2)然后与制备好的1×107的E.coliO157:H7和在合适体积的结合缓冲溶液中混匀，37℃摇床180r/min孵育1h，使ssDNA文库与细菌充分作用；3)8000r/min离心10min，弃上清，使用洗涤缓冲液洗涤(为了增加结合强度，随着轮数的增加洗涤次数相应增加)；4)将洗涤后结合ssDNA的细菌沉淀溶于100μl双蒸水中，作为模板，使用引物P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性核酸适配体，其特征在于：核苷酸序列为序列表<400>1所示序列。

【技术特征摘要】
2016.12.23 CN 20161120348071.一种特异性核酸适配体，其特征在于：核苷酸序列为序列表<400>1所示序列。2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于：与肠出血性大肠杆...

【专利技术属性】
技术研发人员：谌志强，邱志刚，李君文，金敏，杨栋，刘伟丽，王景峰，江建华，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12