一种数字等温核酸检测装置及其检测方法制造方法及图纸

本发明专利技术提供一种数字等温核酸检测装置，其包括微流控芯片、温控系统及压力驱动系统，所述微流控芯片通过基板层、设于所述基板层上的通道层及设于所述通道层上方的盖片层依次层合形成用于微滴生成的微流控通道和用于核酸扩增的反应区间；温控系统包括自下向上对所述基板层施加压力的下压板及自上向下对所述盖片层施加压力的上压板，所述上压板及所述下压板内均设有温度传感芯片及用于对反应区间进行加热的温控加热元件；压力驱动系统连接于所述微流控芯片，用于向微流控芯片内通道层施加压力，以使待测液自流入端流入反应区间内。本案公开的数字等温核酸检测装置及检测方法实现微滴制备、核酸扩增检测于一体，具有灵敏度高等特点。

Digital isothermal nucleic acid detection device and detection method thereof

The invention provides a digital isothermal nucleic acid detection device, which comprises a microfluidic chip, temperature control system and pressure driving system, the microfluidic chip through the substrate layer, which is arranged on the substrate layer on the channel layer and arranged on the channel layer above the cover layer are laminated to form a microfluidic channel for droplet the formation of the interval for the reaction of nucleic acid amplification; the temperature control system comprises an upper plate from the bottom to the lower platen and self on the substrate layer pressure down on the cover sheet of pressure, the upper plate and the lower pressure plate is provided with temperature sensing chip and temperature control for heating elements heating the reaction interval; the pressure driving system is connected to the microfluidic chip, for applying pressure to the channel microfluidic chip layer, so that the liquid flowing into the inflow end reaction interval. The invention discloses a digital isothermal nucleic acid detection device and a detection method, which realizes the preparation of the micro drop and the detection of nucleic acid amplification.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物医学核酸检测装置，特别涉及一种用于核酸数字等温扩增的微流控装置及其检测方法。
技术介绍
当前生物医学研究正从整体和细胞水平深入到分子水平。核酸是细胞内一类重要的生物分子，参与调控细胞的大部分功能，如基因的表达和沉默、细胞器组成以及细胞行为调控等。了解核酸在不同细胞的含量与分布对深入研究其功能及其背后生物学意义至关重要，对恶性肿瘤、艾滋病、遗传性疾病的诊断和治疗具有重要意义。现有的核酸检测主要采用聚合酶链式反应技术(PCR)，PCR方法灵敏度高、特异性好，是目前最常用的基因诊断方法。然而PCR方法操作起来较复杂，对仪器和人员要求比较高，不适合基层或现场快速诊断。而且有些样品稀少无法在实验室培养，样品量不足以进行传统的PCR核酸分析，例如肿瘤循环细胞、组织微阵列、早期发育的胚胎细胞等，这些都是核酸分析遇到的难题。等温扩增技术(IsothermalAmplificationTechnology)是核酸体外扩增技术，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物来达到快速核酸扩增的目的。常见的等温扩增技术包括环介导核酸等温扩增技术LAMP、滚环扩增技术RCA、单引物等温扩增SPIA、依赖解旋酶的等温扩增技术HAD、链替代扩增SDA、交叉引物扩增技术CPA等。等温扩增技术具有操作简便、反应时间短、灵敏度高等优点，适合快速诊断领域。但现有的等温扩增技术无法实现样品的准确和绝对定量，限制了其应用。数字PCR(DigitalPCR)技术是20世纪末由Vogelstein等人提出的一种高灵敏度核酸检测和定量方法。数字PCR通过将一个标准PCR反应分配到大量微小的反应器中，在每个反应器中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，实现“单分子模板PCR扩增”，扩增结束后，通过呈现阳性阴性信号类型的反应器比例和数目进行统计学分析，可以实现真正意义上的绝对定量分析。现有的数字PCR技术多采用流式检测技术，对仪器要求较高，且检测时间长，无法满足核酸现场快速检测需求。
技术实现思路
针对上述技术中存在的不足之处，本专利技术提供一种便携式、快速、灵敏、可绝对定量的数字等温核酸扩增装置。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，本专利技术通过以下技术方案实现：一种数字等温核酸检测装置，其包括，微流控芯片，其通过呈片层结构的基板层、设于所述基板层上的通道层及设于所述通道层上方的盖片层依次层合形成用于微滴生成的微流控通道和用于核酸扩增的反应区间；温控系统，其包括自下向上对所述基板层施加压力的下压板及自上向下对所述盖片层施加压力的上压板，所述上压板及所述下压板内均设有温度传感芯片及用于对反应区间进行加热的温控加热元件，所述温控加热元件为加热片，所述温度传感芯片及所述温控加热元件均贴合于施压面设置；压力驱动系统，其连接于所述微流控芯片，用于向微流控芯片内通道层施加压力，以使待测液自流入端流入反应区间内。优选的是，其中，所述压力驱动系统为真空负压系统或由注射泵驱动的正压系统。优选的是，其中，所述微流控芯片包括依次相连的加样孔、流动相孔、生成微滴乳液的微通道、用于核酸扩增及检测的反应腔及设于所述微流控芯片尾端的的反应腔孔。优选的是，其中，所述压力驱动系统选用真空负压系统时，真空负压系统通过管路与反应腔孔相连，且所述真空负压系统通过电磁阀控制其与所述反应腔孔之间的连接，所述管路末端与所述反应腔孔之间通过橡胶圈压紧密封；所述真空负压系统与所述反应腔孔之间还设置有缓冲瓶。优选的是，其中，所述加样孔体积为5μl～50μl；所述流动相孔体积为40μl～200μl；所述微通道宽度为10μm～200μm，所述微通道深度为10μm～200μm；所述反应腔深度为10μm～200μm。优选的是，其中，所述基板层的材料选用玻璃、聚二甲基硅氧烷/聚甲基丙烯酸甲酯/聚碳酸酯、聚四氟乙烯、耐热透明胶带、聚对苯二甲酸乙二醇酯膜中的一种；所述通道层的材料选用聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、玻璃或聚四氟乙烯中的一种；所述盖片层的材料选用玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯或聚碳酸酯中的一种。优选的是，其中，所述基板层、所述通道层及所述盖片层层合方式为热键合、耐热透明胶带粘合、耐热胶粘合或氧气等离子体处理中的一种，层合后采用0.5～5％含氟硅烷进行表面疏水处理。优选的是，其中，所述通道层选用聚二甲基硅氧烷制成，所述基板层及所述盖片层表面在层合前需用聚二甲基硅氧烷预先包被处理。优选的是，其中，所述压力驱动系统为由注射泵驱动的正压系统，所述正压系统通过管路与样品孔和流动相孔分别相连，所述样品孔及所述流动相孔与所述管路连接处通过橡胶圈压紧密封。进一步地，本专利技术针对上述数字等温核酸检测装置还提供了以下使用方法，通过以下步骤实现：步骤1、将目标DNA分子同等温扩增反应试剂混合，加至样品孔中，将含有氟化表面活性剂的氟化油加至流动相孔中；步骤2、当压力驱动系统为真空负压系统时，将真空负压系统同反应腔连接管路用橡胶圈压紧密封，抽真空，使真空度达到5～50kPa，待真空度稳定后，打开电磁阀；当压力驱动系统为注射泵正压系统时，将注射泵正压系统通过管路与样品孔和流动相孔相连，管路同样品孔及流动相孔之间通过橡胶圈压紧密封，打开注射泵开关；步骤3、样品和氟化油在压力作用下流动并通过流体剪切作用生成微滴，微滴在压力作用下进入反应腔，样品全部生成微滴后，用耐热胶带将进样口和反应腔口密封；步骤4、调节温控系统使芯片温度达到核酸扩增合适温度，保持合适温度至核酸扩增结束；步骤5、扩增结束后，对微流控芯片反应腔中微滴进行荧光显微拍照，通过软件计算阳性微滴与阴性微滴数目，计算目标DNA拷贝数。本专利技术至少包括以下有益效果：1)本专利技术将数字PCR技术同核酸等温扩增技术相结合，克服了传统等温扩增技术无法准确和绝对定量的问题；2)本专利技术利用微流控芯片集成化、微型化特点，实现了样品微滴制备、核酸扩增及检测于一体，简化了操作流程，有效防止了外界污染和核酸交叉污染；3)采用对反应腔中微滴荧光拍照的方式检测，同传统流式检测技术相比，速度更快，对设备要求更低，便于分析设备的便携化和微型化；4)本专利技术采用微滴作用核酸扩增和检测单元，同微孔式和微腔式相比，芯片结构简单，降低了芯片设计加工难度；5)本专利技术结构操作简单，无需配套PCR仪器和数字PCR检测系统，其应用成本较目前数字PCR仪器大大减少，可用于基层本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种数字等温核酸检测装置，其特征在于，包括，微流控芯片，其通过呈片层结构的基板层、设于所述基板层上的通道层及设于所述通道层上方的盖片层依次层合形成用于微滴生成的微流控通道和用于核酸扩增的反应区间；温控系统，其包括自下向上对所述基板层施加压力的下压板及自上向下对所述盖片层施加压力的上压板，所述上压板及所述下压板内均设有温度传感芯片及用于对反应区间进行加热的温控加热元件，所述温控加热元件为加热片，所述温度传感芯片及所述温控加热元件均贴合于施压面设置；压力驱动系统，其连接于所述微流控芯片，用于向微流控芯片内通道层施加压力，以使待测液自流入端流入反应区间内。

【技术特征摘要】
1.一种数字等温核酸检测装置，其特征在于，包括，
微流控芯片，其通过呈片层结构的基板层、设于所述基板层上的通道层及设于所述通
道层上方的盖片层依次层合形成用于微滴生成的微流控通道和用于核酸扩增的反应区间；
温控系统，其包括自下向上对所述基板层施加压力的下压板及自上向下对所述盖片层
施加压力的上压板，所述上压板及所述下压板内均设有温度传感芯片及用于对反应区间进
行加热的温控加热元件，所述温控加热元件为加热片，所述温度传感芯片及所述温控加热
元件均贴合于施压面设置；
压力驱动系统，其连接于所述微流控芯片，用于向微流控芯片内通道层施加压力，以
使待测液自流入端流入反应区间内。
2.根据权利要求1所述的数字等温核酸检测装置，其特征在于，所述压力驱动系统
为真空负压系统或由注射泵驱动的正压系统。
3.根据权利要求2所述的数字等温核酸检测装置，其特征在于，所述微流控芯片包
括依次相连的加样孔、流动相孔、生成微滴乳液的微通道、用于核酸扩增及检测的反应腔
及设于所述微流控芯片尾端的的反应腔孔。
4.根据权利要求3所述的数字等温核酸检测装置，其特征在于，所述压力驱动系统
选用真空负压系统时，真空负压系统通过管路与反应腔孔相连，且所述真空负压系统通过
电磁阀控制其与所述反应腔孔之间的连接，所述管路末端与所述反应腔孔之间通过橡胶圈
压紧密封；所述真空负压系统与所述反应腔孔之间还设置有缓冲瓶。
5.根据权利要求4所述的数字等温核酸检测装置，其特征在于，所述加样孔体积为
5μl～50μl；所述流动相孔体积为40μl～200μl；所述微通道宽度为10μm～200μm，所
述微通道深度为10μm～200μm；所述反应腔深度为10μm～200μm。
6.根据权利要求1所述的数字等温核酸检测装置，其特征在于，所述基板层的材料
选用玻璃、聚二甲基硅氧烷/聚甲基丙烯酸甲酯/聚碳酸酯、聚四氟乙烯、耐热透明胶带、
聚对苯二甲酸乙二醇酯膜中的一种；所述通道层的材...

【专利技术属性】
技术研发人员：张涛，黎海文，周武平，刘聪，蒋克明，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32