一种原位核酸检测方法技术

本发明专利技术公开了一种原位核酸检测方法，该本方法基于双连接探针特异性识别靶序列和通过滚环扩增放大信号，可用于原位检测一种或多种目标核酸。这种新方法产生了一种高信噪比的特异性检测信号，能够实现对样品中的核酸靶序列的检测。

Method for detecting nucleic acid in situ

The present invention discloses an in situ nucleic acid detection method, which is based on double connection probes to recognize target sequences specifically and amplify amplified signals by rolling rings, and can be used for in situ detection of one or more target nucleic acids. This new method yields a high signal-to-noise ratio specific detection signal that enables detection of nucleic acid target sequences in the sample.

【技术实现步骤摘要】
一种原位核酸检测方法
本专利技术属于核酸检测
，具体涉及一种原位核酸检测方法。
技术介绍
核酸原位检测技术能够对细胞和组织样本中的DNA和RNA进行定位检测。传统的核酸原位检测技术为原位杂交技术(ISH)，该方法通过标记的检测探针与目标核酸进行杂交，未结合的探针被洗去，与目标核酸特异杂交的检测探针通过标记被检测，从而实现目标核酸的检测。其中，单分子荧光原位杂交技术(smFISH)通过在单个RNA分子上杂交多个检测探针获得足够强的信号而实现对单个RNA分子进行原位检测。与传统的ISH相比，单分子荧光原位杂交技术具有更高的灵敏度和特异性。通过滚环扩增亦可以实现对信号的放大，其前提是将检测目标核酸分子转化为检测与目标核酸分子特异对应的环状核酸分子。锁式探针法单分子RNA原位检测技术就是这样的一种方法，该方法除了能够检测单分子RNA，还能够实现对碱基变异的检测。该方法通过一条单链DNA构成锁式探针的两段区域与目标核酸的靶序列特异杂交，当探针两端的碱基与靶序列完全互补时，DNA连接酶将探针两端连接形成一个环状DNA分子，而后通过滚环扩增(RCA)对环状DNA分子进行扩增，最后再用检测探针检测扩增产物实现对目标RNA的检测。对碱基突变的检测通常由带有特异检测探针结合区域的两条或者两条以上的锁式探针同时与目标核酸的靶序列竞争杂交，最终完全互补的锁式探针结合到靶序列上并进一步被连接和扩增，通过特异的检测探针获得变异碱基的信息。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种原位核酸检测方法，高度整合了原位杂交技术、滚环扩增技术和双连接探针技术，实现对样品中的核酸靶序列的检测。本专利技术的技术方案如下：一种原位核酸检测方法，包括如下步骤：(1)使至少一对连接探针与待测样品中的靶序列特异的杂交互补；每对连接探针中包括一上游探针和一下游探针：上游探针的3’端具有一与上述靶序列的上游序列特异互补的上游识别序列，5’端具有一上游成环连接模板互补序列；下游探针的5’端具有一与上述靶序列的下游序列特异互补的下游识别序列，3’端具有一下游成环连接模板互补序列；上述靶序列的上游序列和下游序列互不重叠；(2)通过连接酶将与待测样品中的靶序列特异的杂交互补的上游识别序列和下游识别序列连接起来，形成至少一第一序列；(3)使至少一成环连接模板同时与至少一第一序列两侧的上游成环连接模板互补序列和下游成环连接模板互补序列特异的杂交互补，上述上游成环连接模板互补序列和下游成环连接模板互补序列相对成环连接模板互不重叠；(4)通过连接酶将与上述成环连接模板特异的杂交互补的上游成环连接模板互补序列和下游成环连接模板互补序列连接起来，得到至少一环形模板；(5)对上述至少一环形模板通过滚环扩增，得到至少一滚环扩增产物；(6)将上述至少一滚环扩增产物与至少一检测探针杂交以进行检测。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述靶序列为DNA、RNA或RNA通过逆转录产生的cDNA。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述检测探针修饰有荧光标记物、显色标记物、酶标记物、放射性标记物、磁性标记物或发光密度标记物。在本专利技术的一个优选实施方案中，至少一对连接探针中含有自然和/或非自然核苷酸。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述成环连接模板中含有自然和/或非自然核苷酸。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述待测样品包括培养的细胞、组织和组织切片中的细胞。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述连接酶包括T4DNA连接酶和AmpligaseDNA连接酶。本专利技术的有益效果：本专利技术能够有效的实现对目标核酸的检测，信噪比高，特异性好。附图说明图1为本专利技术中的一对连接探针的结构示意图。图2为本专利技术的原理示意图。图3为本专利技术实施例1的检测结果图。具体实施方式以下通过具体实施方式结合附图对本专利技术的技术方案进行进一步的说明和描述。实施例1人皮肤成纤维细胞为实验样品考察双连接探针法原位检测细胞ACTBmRNA。(一)细胞培养与固定：人皮肤成纤维细胞经DMEM(含10％FBS)培养24-48h后，用胰蛋白酶处理成悬浮细胞，并种板于表面带多聚赖氨酸的无菌载玻片上，重新培养12-24h。DEPC-PBS冲洗，3×3min；用DEPC-PBS配置的3％PFA常温固定30min；再次用DEPC-PBS冲洗一次后，分别经梯度乙醇：70％、85％、100％脱水处理，各5min。空气晾干。(二)ACTB的mRNA原位逆转录对人成纤维细胞的细胞膜进行透膜打孔，在样本上加入0.1MHCl室温下孵育5min。用DEPC-PBS-Tween20洗三次后进行ACTBmRNA的原位逆转录。在反应体系中，以样本中所含有的ACTB的mRNA为模板，加入50uL含有1mMdNTP、1μM逆转录引物(5'-CTGACCCATGCCCACCATCACGCCC-3’，SEQIDNO01)和20u/uLRevertAidHminusM-MuLV逆转录酶(Fermentas)以及1u/μLRiboLockRNA酶抑制剂(Fermantas)以及终浓度为1x的RTbuffer(Fermantas)的逆转录混合液，mRNA分子在原位下被逆转录成cDNA。37℃下孵育3小时后，用DEPC-PBS-Tween20洗三次。(三)原位核酸检测，如图1和图所示，具体包括如下步骤：(1)双连接探针杂交连接在样品加入50uL含有终浓度为1×的Ampligasebuffer(Epicenter)、0.1μM上游探针、0.1μM下游探针、0.5U/μLAmpligase(Epicenter)、1u/μLRiboLockRNA酶抑制剂(Fermantas)、50mMKCl和20％甲酰胺的连接反应混合液，37℃下孵育30分钟后，45℃下孵育45分钟。使一对连接探针与上述cDNA中的靶序列特异的杂交互补；每对连接探针中包括一上游探针(5'-GCCGGCTTCGCGGGCGACGATTCCTCTATGATTACTGACCTATGC-3’，SEQIDNO02)和一下游探针(5'-GTCTATTTAGTGGAGCCTCTTCTTTACGGCGCCGGCATGTGCAAG-3’，SEQIDNO03)：上游探针的3’端具有一与上述靶序列的上游序列特异互补的上游识别序列，5’端具有一上游成环连接模板互补序列；下游探针的5’端具有一与上述靶序列的下游序列特异互补的下游识别序列，3’端具有一下游成环连接模板互补序列；上述靶序列的上游序列和下游序列互不重叠；具体的，上述上游探针和下游探针经T4PNK磷酸化处理(将含有2μM探针、1×PNKbufferA(Fermentas)、1mMATP、0.1u/μLT4多聚核苷酸激酶(Fermantas)的反应混合物在37℃条件下先反应10min，然后在65℃继续反应10min，完成后-20℃保存备用)。通过AmpligaseDNA连接酶将与靶序列特异的杂交互补的上游识别序列和下游识别序列连接起来(连接反应条件为37℃，30min后45℃，45min)，形成一第一序列；反应完成后用DEPC-PBS-Tween20洗三次。(2)探针成环在样本中加入50uL含有终浓度为1×的Ampligasebuffer(Epicenter)、1μM成环模板寡核酸(5'-CTAAATAG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种原位核酸检测方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)使至少一对连接探针与待测样品中的靶序列特异的杂交互补；每对连接探针中包括一上游探针和一下游探针：上游探针的3’端具有一与上述靶序列的上游序列特异互补的上游识别序列，5’端具有一上游成环连接模板互补序列；下游探针的5’端具有一与上述靶序列的下游序列特异互补的下游识别序列，3’端具有一下游成环连接模板互补序列；上述靶序列的上游序列和下游序列互不重叠；(2)通过连接酶将与待测样品中的靶序列特异的杂交互补的上游识别序列和下游识别序列连接起来，形成至少一第一序列；(3)使至少一成环连接模板同时与至少一第一序列两侧的上游成环连接模板互补序列和下游成环连接模板互补序列特异的杂交互补，上述上游成环连接模板互补序列和下游成环连接模板互补序列相对成环连接模板互不重叠；(4)通过连接酶将与上述成环连接模板特异的杂交互补的上游成环连接模板互补序列和下游成环连接模板互补序列连接起来，得到至少一环形模板；(5)对上述至少一环形模板通过滚环扩增，得到至少一滚环扩增产物；(6)将上述至少一滚环扩增产物与至少一检测探针杂交以进行检测。

【技术特征摘要】
1.一种原位核酸检测方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)使至少一对连接探针与待测样品中的靶序列特异的杂交互补；每对连接探针中包括一上游探针和一下游探针：上游探针的3’端具有一与上述靶序列的上游序列特异互补的上游识别序列，5’端具有一上游成环连接模板互补序列；下游探针的5’端具有一与上述靶序列的下游序列特异互补的下游识别序列，3’端具有一下游成环连接模板互补序列；上述靶序列的上游序列和下游序列互不重叠；(2)通过连接酶将与待测样品中的靶序列特异的杂交互补的上游识别序列和下游识别序列连接起来，形成至少一第一序列；(3)使至少一成环连接模板同时与至少一第一序列两侧的上游成环连接模板互补序列和下游成环连接模板互补序列特异的杂交互补，上述上游成环连接模板互补序列和下游成环连接模板互补序列相对成环连接模板互不重叠；(4)通过连接酶将与上述成环连接模板特异的杂交互补的上游成环...

【专利技术属性】
技术研发人员：柯荣秦，林辰，陈小媛，
申请(专利权)人：华侨大学，
类型：发明
国别省市：福建,35