抗稻瘟病基因Pigm的检测方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种抗稻瘟病基因

Method for detecting rice blast gene Pigm and its application

The present invention relates to a rice blast resistance gene

【技术实现步骤摘要】
抗稻瘟病基因Pigm的检测方法及其应用
本专利技术属于农业生物
，具体涉及一种稻瘟病抗性基因Pigm的特异分子标记的高分辨率熔解曲线分析(High-ResolutionMeltingCurveAnalysis,HRM)稻瘟病抗性基因Pigm的特异分子标记，以及利用所述引物检测稻瘟病抗性基因Pigm的方法。
技术介绍
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，超过一半的世界人口以稻米为主食，我国超过60％的人口以稻米为主食。由子囊菌(Magnapotheoryzae)引起的稻瘟病是广泛发生在世界各稻区影响水稻生产的重要病害之一，每年都会造成严重的粮食损失。实践证明，选育和种植广抗病品种是防治水稻病害最经济有效的方法。近年来，水稻抗稻瘟病基因的克隆取得了重要进展，稻瘟病抗性基因的分子标记的开发对于培育抗稻瘟病水稻品种具有重要意义。到目前为止，至少有9个稻瘟病抗性基因(Pi2,Piz,Piz-t,Pi40,Pigm,Pi9,Pi26,Pi50,Pi2-2)己经被定位在水稻第6染色体短臂端的Pi2/9基因簇内，这些基因都被认为是稻瘟病广谱抗性基因，在稻瘟病抗性育种方面具有重要的应用价值(Jiangetal.,2012)。其中，水稻稻瘟病主效显性基因Pigm为广谱抗性基因，其抗谱明显强于广谱抗性基因Pi2、Pi9等，在抗病育种中具有更高的应用价值。Pigm来自籼稻谷梅4号，对收集自中国、法国和泰国的30个强致病菌株中的29个表现高抗或免疫，定位于水稻第染色体上标记C5483和C0428之间的70-kb区间内，与标记PC22705、C24901、S29742共分离，与Pi2、Pi9紧密连锁或等位，在该区间中，通过日本晴的序列进行预测，发现有6个NBS-LRR结构域的基因，但Pigm具体是哪个基因还没有功能确认(Dengetal.,2006；Jiaetal.,2008；Dengetal.,2009)。由于Pigm基因还没有克隆，无法知道其详细的DNA序列，就不能针对其功能变异设计特异性的引物来检测其存在与否。为了检测Pigm基因，何祖华等和许一文等分别开发了显性分子标记M80362和M20265。但是这两个标记对Pigm基因的检测结果是根据目的条带的有无来判断的，这样的标记稳定性不好，实验结果重复性不强，在大规模分子辅助选择育种中存在着很大的局限性。周亮等设计了4对Indel引物S29742、S2997、S1408、S2723，共同能够将谷梅4号和其它95个亲本材料全部分开。同时，这4对引物对谷梅4号杂交后代的分离群体的分子检测检测结果和田间抗性鉴定的结果完全一致，使MAS的效率达到100％，表明这些标记与Pigm共分离，完全能够满足大规模分子标记辅助育种的要求。但是，对基因的共分离跟踪在基因没有克隆的条件下，一般只需要在基因的两端各设计一对引物即可满足要求，而周亮等对Pigm的跟踪选择却需要4对引物的共同检测才能实现这一目的。因此，有必要重新在Pigm的两端各开发一对新的共分离引物来对Pigm基因进行分子辅助选择。高分辨率熔解曲线分析技术(HighResolutionMelting，HRM)是近几年兴起的由犹他大学和爱德华科技公司合作开发的一种单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)以及突变研究的工具。它通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，来判断是否存在SNP，而且不同SNP位点、是否是杂合子等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM分析能够有效区分不同SNP位点与不同基因型。这种检测方法不受突变碱基位点与类型的局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨率熔解，即可完成对样品基因型的分析。该方法无需设计探针，操作简便、快速，成本低，结果准确，并且实现了真正的闭管操作。在植物育种上，HRM可用于突变扫描、基因分型、基于特定基因的种质资源鉴定以及功能标记开发等方面，对于SNP、InDel等多种标记的开发和利用具有重要的价值。通过本团队自主开发设计的水稻60K基因芯片对谷梅4号、武运粳7号和9311进行全基因组扫描，选择在Pigm基因两端附近谷梅4号与武运粳7号和9311都不同的变异位点来设计HRM引物，在两端各开发一个与Pigm完全共分离的分子标记，并建立中高通量辅助选择体系，能够大大提高水稻抗病育种选育的效率。
技术实现思路
Pigm基因定位于水稻第染色体上标记C5483和C0428之间的70-kb区间内的Pi2/9基因簇上，一直没有该基因的克隆报道和序列的公布。研究表明，主效显性基因Pigm为广谱抗性基因，其抗谱明显强于广谱抗性基因Pi2、Pi9等，在抗病育种中具有更高的应用价值，而分子标记辅助选择在抗稻瘟病聚合育种中具有重要的作用，能够大大提高水稻育种选育的效率。以前的Pigm分子标记研究中，要么引物稳定性不好，实验结果重复性不强，要么需要4对甚至更多对的引物才能完成基因的跟踪选择，在大规模分子辅助选择育种中存在着很大的局限性。对于这种还未公布序列的基因的分子标记开发，最有效的方法是在基因两端附近分别开发一个完全共分离的分子标记，因此有必要在对Pigm的分子标记进行重新设计，以便提高分子辅助育种是效率。利用水稻60K基因芯片(PCT/CN2013/000131)对谷梅4号、武运粳7号和9311进行全基因组扫描，选择在Pigm基因两端附近谷梅4号与武运粳7号和9311都不同的变异位点(如表1)来设计HRM引物，在两端各开发一个与Pigm完全共分离的分子标记，分别为Pigm-HRM-1和Pigm-HRM-2。在基因两侧都开发连锁的分子标记对基因进行跟踪，能够最大限度的防止导入基因的丢失，这是目前对只定位而没有克隆基因进行分子标记辅助选择的最有效的方法。本专利技术所要解决的技术问题是提供一种利用分子标记快速、准确检测抗稻瘟病基因Pigm的方法，本专利技术提供两对结合高分辨率熔解曲线分析技术——HRM用于检测抗稻瘟病基因Pigm的分子标记引物，所述引物根据Pigm基因两端附近的基因特异性单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)设计，可以结合HRM用于Pigm基因的辅助选择，以提高水稻分子标记辅助选择的效率以及抗病品种选育的效率。本专利技术提供如下解决方案：两对结合HRM用于检测抗稻瘟病基因Pigm的分子标记引物，其上、下游序列分别为：Pigm-HRM-1F：5'-GCTTAATCAAGCCCATTTCC-3'(SEQIDNO:1)；Pigm-HRM-1R：5'-AGCCCACAAGTTCTGACTCG-3'(SEQIDNO:2)；Pigm-HRM-2F：5'-AAGCTGTCACGACCTGAGAAG-3'(SEQIDNO:3)；Pigm-HRM-2R：5'-CGTGCTCACCTGTGAGTTCTA-3'(SEQIDNO:4)；上述引物根据水稻60K基因芯片在Pigm基因两端附近在谷梅4号与武运粳7号和9311的特异性SNP设计(如表1)，两个变异位点分别为T→C和A→C。一种结合HRM检测水稻抗稻瘟病Pigm的方法：利用上述两对引物扩增23份待测水稻材料的基因组DNA(如表2)，取扩增产物用HRM仪器L本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种

【技术特征摘要】
2016.12.29 CN 20161125132901.一种Pigm基因的检测引物，其特征在于所述引物的正向引物是5'-GCTTAATCAAGCCCATTTCC-3'，反向引物是5'-AGCCCACAAGTTCTGACTCG-3'。2.一种Pigm基因的检测引物，其特征在于所述引物的正向引物是5'-AAGCTGTCACGACCTGAGAAG-3'，反向引物是5'-CGTGCTCACCTGTGAGTTCTA-3'。3.一种Pigm基因的HRM检测方法，其特征在于所述HRM检测方法包含两对检测引物，所述检测引物1的正向引物是5'-GCTTAATCAAGCCCATTTCC-3'，反向引物是5'-AGCCCACAAGTTCTGACTCG-3'；检测引物2的正向引物是5'-AAGCTGTCACGACCTGAGAAG-3'，反向引物是5'-CGTGCTCACCTGTGAGTTCTA-3'。4.根据权利要求3所述的HRM检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：a）提取待测样本DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：金名捺，丘式浚，唐晓艳，邓兴旺，
申请(专利权)人：深圳兴旺生物种业有限公司，深圳市作物分子设计育种研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44