本发明专利技术属于转基因作物食品检测技术领域，尤其涉及一种转基因EPSPS检测ELISA试剂盒的检测方法，包括免疫多肽混合样品的选择，EPSPS多克隆抗体的制备，EPSPS多克隆抗体的纯化，标准品的稀释，样品加样，温育、配液及洗涤，EPSPS抗体的加入，HRP抗体的加入，显色剂和终止液的加入及测定显示。本试剂盒的抗体制备选择的多肽，具有极高的亲水性、免疫性以及特异性，产生抗体的效价高，特异性好，且检测的结果可靠。采用的该检测方法，通量高和灵敏度高，能同时快速检测多个样品。还可以定性检测样品是否含有epsps成分，更能根据标准品准确算出其具体含量，可以用肉眼观察，也可以用酶标仪读取(D450)。与标准曲线比较，可以精确定量EPSPS的含量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于转基因作物食品检测
，尤其涉及一种转基因EPSPS检测ELISA试剂盒的方法。
技术介绍
转基因技术关系到国家未来粮食生产技术的自主性和创新性，大力推进转基因技术的自主研发，占领转基因技术的制高点对于国家安全具有重大意义。但由于转基因食品的安全性仍存在争议，国家对于转基因食品安全性有一套严格的安全评价体系，对市面上非法转基因食品的监管也在日益加强。如何充分合理地评估转基因粮食可能带来的风险，并未雨绸缪提前做好防范和规避风险的准备，已成为生产者和决策者面临的头等大事。草甘膦是一种非选择性除草剂，其作用机理主要是竞争性抑制莽草酸途径中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性。该合成酶是真菌、细菌、藻类、高等植物体内芳香族氨基酸生物合成过程中一个关键酶。草甘膦基天然存在于多个物种中，它们的长度及位置都有所不同，但是都能共同编码抗草甘膦酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶。通过该酶的作用，可以阻断草甘膦对生物合成途径的干扰，从而使菌种或植物不被草甘膦杀灭。因此，农作物中转入(EPSPS)基因，可使施用于农田的草甘膦只作用于杂草，而不影响作物的正常生长，因此，对于提高作物产量及减轻劳动量、提高劳动效率大有裨益。已成功实现转入该基因的作物有油菜、玉米、棉花及烟草等。目前常用的转基因检测方法，如胶体金免疫层析检测条、PCR—聚合酶链式反应技术、荧光PCR技术等。荧光定量PCR(qPCR)技术是目前主流的分子检测技术，相关产品占据全球分子诊断市场的一半。然而这种技术由于核酸检测过程复杂、实现核酸扩增信号检测设备价格高、对实验室硬件条件要求高等问题，只局限于高端市场，普及推广困难，基层医疗和检测机构需求得不到满足。
技术实现思路
本专利技术提供了一种检测准确性好、能够一次实现多个转基因EPSPS检测ELISA试剂盒的方法，以解决上述技术问题。为了达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种转基因EPSPS检测ELISA试剂盒的方法，包括如下步骤：步骤一、免疫多肽混合样品的选择：所述免疫多肽混合样品选择编号是Pc_19–32、Pc_67–77、Pc_141–156和Pc_312–324的多肽混合样品；步骤二、EPSPS多克隆抗体的制备：第一次多肽混合样品加入等体积的完全弗氏佐剂完全乳化后，背部皮下注射免疫，每只兔子免疫混合多肽0.5mg，且后三次直接用不完全弗氏佐剂完全乳化免疫，每次间隔14天，免疫剂量和部位与第一次相同，所述最后一次免疫10天后，心脏取血，4℃保存过夜，10000g10min4℃离心，收集上清即为抗血清(多克隆抗体)；步骤三、EPSPS多克隆抗体的纯化：抗体样品(即抗血清)加入1/10体积的1mol/LTris(pH8.0)将PH调含至8.0，所述将抗体溶液通过蛋白A微球柱，且微球柱每毫升的湿微球能结合大约10—20ml抗体(1个蛋白A或蛋白G微球分子结合2分子抗体)，同时，记录装柱微球的大约体积，且微球柱的体积决定使用清洗和洗脱缓冲液的量；步骤四、标准品的稀释：所述在第一孔中分别加标准品100μl，然后在第一孔中样品稀释液100μl，混匀；然后从第一孔中取100μl分别加到第二孔，再在第二孔加样品稀释液100μl，混匀；以此类推，到第七孔，混匀后取100μl弃掉，第八孔直接加加样品稀释液100μl；步骤五、样品加样：所述在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液90μl，然后再加待测样品10μl，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；步骤六、温育、配液及洗涤：先用封板膜封板后置37℃温育60分钟；再将10倍浓缩洗涤液用蒸馏水10倍稀释后备用；小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复2次，拍干；步骤七、EPSPS抗体的加入：每孔加入酶标试剂50μl(EPSPS抗体用抗体稀释液稀释50倍)，温育60分钟，洗涤5遍；步骤八、HRP抗体的加入：每孔加入酶标试剂50μl(EPSPS抗体用抗体稀释液稀释50倍)，温育30分钟，洗涤5遍。步骤九、显色剂和终止液的加入：每孔先加入显色剂(A50μl+B50μl)，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)；步骤十、测定结果分析：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。优选的，所述EPSPS多克隆抗体的纯化还包括如下步骤：首先，用10倍柱体积的100mmol/LTris(pH8.0)洗涤微球；然后，用10倍柱体积的10mmol/LTris(pH8.0)洗涤微球；最后，用50mmol/L甘氨酸(pH3.0)洗脱微球柱，每次加入约1/2柱体积的缓冲液，分次加入；接着用含1/10柱体积的1mol/LTris(pH8.0)的试管收集洗脱液，将各管缓慢摇匀，使其pH值恢复至中性，将含抗体的收集管混合，-20℃保存。进一步的说，所述对应第一孔至第八孔的浓度依次分别为10mg/L、5mg/L、2.5mg/L、1.2mg/L、0.6mg/L、0.3mg/L、0.15mg/L、0mg/L。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本试剂盒的抗体制备选择的多肽，具有极高的亲水性、免疫性以及特异性，产生抗体的效价高，特异性好，且检测的结果可靠；采用该检测方法，通量高和灵敏度高，能同时快速检测多个样品；还可以定性检测样品是否含有epsps成分，更能根据标准品准确算出其具体含量，可以用肉眼观察，也可以用酶标仪读取(D450),与标准曲线比较，可以精确定量EPSPS的含量。附图说明图1为本专利技术CP4-EPSPS氨基酸序列Q9R4E4.2(孟山都)的示意图；图2为本专利技术生物信息学分析候选免疫多肽的示意图；图3为本专利技术EPSPS多克隆抗体的制备示意图；图4为本专利技术EPSPS多克隆抗体的纯化示意图；图5为本专利技术ELISA试剂盒检测图；图6为本专利技术的检测流程图；具体实施方式以下将结合附图对本专利技术的技术方案进行详细说明：如图1所示：为CP4-EPSPS氨基酸序列Q9R4E4.2(孟山都)；CP4-EPSPS为市场上主流抗除草剂基因，Q9R4E4.2为其在NCBI上的基因号。如图2所示：为生物信息学分析候选免疫多肽；通过分析(Maranietal.,InSilicoPeptidePredictionforAntibodyGen本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种转基因EPSPS检测ELISA试剂盒的方法，其特征在于，包括免疫多肽混合样品的选择，EPSPS多克隆抗体的制备，EPSPS多克隆抗体的纯化，标准品的稀释，样品加样，温育、配液及洗涤，EPSPS抗体的加入，HRP抗体的加入，显色剂和终止液的加入及测定显示，其步骤如下：步骤一、免疫多肽混合样品的选择：所述免疫多肽混合样品选择编号是Pc_19–32、Pc_67–77、Pc_141–156和Pc_312–324的多肽混合样品；步骤二、EPSPS多克隆抗体的制备：第一次多肽混合样品加入等体积的完全弗氏佐剂完全乳化后，背部皮下注射免疫，每只兔子免疫用混合多肽0.5mg，且后三次直接用不完全弗氏佐剂完全乳化免疫，每次间隔14天，免疫剂量和部位与第一次相同，所述最后一次免疫10天后，心脏取血，4℃保存过夜，10000g10min 4℃离心，收集上清即为抗血清(多克隆抗体)；步骤三、EPSPS多克隆抗体的纯化：抗体样品(即抗血清)加入1/10体积的1mol/L Tris(pH8.0)将PH调含至8.0，所述将抗体溶液通过蛋白A微球柱，且微球柱每毫升的湿微球能结合大约10—20ml抗体(1个蛋白A或蛋白G微球分子结合2分子抗体)，同时，记录装柱微球的大约体积，且微球柱的体积决定使用清洗和洗脱缓冲液的量；步骤四、标准品的稀释：所述在第一孔中分别加标准品100μl，然后在第一孔中样品稀释液100μl，混匀；然后从第一孔中取100μl分别加到第二孔，再在第二孔加样品稀释液100μl，混匀；以此类推，到第七孔，混匀后取100μl弃掉，第八孔直接加加样品稀释液100μl；步骤五、样品加样：所述在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液90μl，然后再加待测样品10μl，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；步骤六、温育、配液及洗涤：先用封板膜封板后置37℃温育60分钟；再将10倍浓缩洗涤液用蒸馏水10倍稀释后备用；小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复2次，拍干；步骤七、EPSPS抗体的加入：每孔加入酶标试剂50μl(EPSPS抗体用抗体稀释液稀释50倍)，温育60分钟，洗涤5遍；步骤八、HRP抗体的加入：每孔加入酶标试剂50μl(EPSPS抗体用抗体稀释液稀释50倍)，温育30分钟，洗涤5遍。步骤九、显色剂和终止液的加入：每孔先加入显色剂(A50μl+B50μl)，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)；步骤十、测定结果分析：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。...
【技术特征摘要】
1.一种转基因EPSPS检测ELISA试剂盒的方法，其特征在于，包括免疫多
肽混合样品的选择，EPSPS多克隆抗体的制备，EPSPS多克隆抗体的纯化，标准
品的稀释，样品加样，温育、配液及洗涤，EPSPS抗体的加入，HRP抗体的加入，
显色剂和终止液的加入及测定显示，其步骤如下：
步骤一、免疫多肽混合样品的选择：所述免疫多肽混合样品选择编号是
Pc_19–32、Pc_67–77、Pc_141–156和Pc_312–324的多肽混合样品；
步骤二、EPSPS多克隆抗体的制备：第一次多肽混合样品加入等体积的完
全弗氏佐剂完全乳化后，背部皮下注射免疫，每只兔子免疫用混合多肽0.5mg，
且后三次直接用不完全弗氏佐剂完全乳化免疫，每次间隔14天，免疫剂量和部
位与第一次相同，所述最后一次免疫10天后，心脏取血，4℃保存过夜，10000g
10min4℃离心，收集上清即为抗血清(多克隆抗体)；
步骤三、EPSPS多克隆抗体的纯化：抗体样品(即抗血清)加入1/10体积
的1mol/LTris(pH8.0)将PH调含至8.0，所述将抗体溶液通过蛋白A微球
柱，且微球柱每毫升的湿微球能结合大约10—20ml抗体(1个蛋白A或蛋白G
微球分子结合2分子抗体)，同时，记录装柱微球的大约体积，且微球柱的体积
决定使用清洗和洗脱缓冲液的量；
步骤四、标准品的稀释：所述在第一孔中分别加标准品100μl，然后在第
一孔中样品稀释液100μl，混匀；然后从第一孔中取100μl分别加到第二孔，
再在第二孔加样品稀释液100μl，混匀；以此类推，到第七孔，混匀后取100
μl弃掉，第八孔直接加加样品稀释液100μl；
步骤五、样品加样：所述在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液90
μl，然后再加待测样品10μl，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔
<...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘登念，凌琳，
申请(专利权)人：湖北久华食安生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。