基于多个基因诊断胃癌患者的检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种基于多个基因诊断胃癌患者的检测试剂盒，试剂盒包括引物探针组合物甲、引物探针组合物乙、引物探针组合物丙、引物探针组合物丁和引物探针组合物戊；引物探针组合物甲包括特异性引物对甲、封闭引物甲和探针甲；引物探针组合物乙包括特异性引物对乙、封闭引物乙和探针乙；引物探针组合物丙包括特异性引物对丙、封闭引物丙和探针丙；引物探针组合物丁包括特异性引物对丁、封闭引物丁和探针丁；引物探针组合物戊包括特异性引物对戊、封闭引物戊和探针戊。本发明专利技术提供的试剂盒，可以应用于诊断胃癌，为胃癌的诊断提供了一条快速、可靠、准确的新途径，本发明专利技术将在医学检测领域发挥重要作用。

Detection kit for diagnosing gastric cancer patients based on multiple genes

The invention relates to a multiple gene diagnosis in patients with gastric cancer detection kit based on the kit comprises a primer probe composition a, B and primer probe primer probe composition composition, composition and d c primer probe primer probe e composition; composition comprises a primer probe specific primers of a primer and probe, closed a nail; the composition includes B primer probe specific primer primer and probe B closed B to B and C; primer probe compositions include specific primers and probes for closed primer c c c, D; primer probe compositions include specific primers of Ding, Ding Ding and closed primer probe; probe primer composition including specific primers of pentyl amyl primers and probes were closed, e. The kit provided by the invention can be applied to the diagnosis of gastric cancer, and provides a fast, reliable and accurate method for the diagnosis of gastric cancer.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种基于多个基因诊断胃癌患者的检测试剂盒。
技术介绍
在我国，消化道系统肿瘤的发病率排在第一位，其中最高的是胃癌。全球每年胃癌发病人数约为87万，我国就有30多万。1962年日本胃癌研究会正式提出早期胃癌(EGC)的概念，这是胃癌诊断和治疗一个里程碑的事件，由于早期胃癌概念的提出，使得胃癌达到临床治愈、获得长期存活成为可能。历经半个世纪的研究与诊治工作，对于早期胃癌的认识也逐步深入，对早期胃癌的诊断也得以逐渐精细，特别是近年来，对于早期胃癌治疗的指导思想由原来的片面追求根治效果延长生存期转变为不仅要求有长期的存活率，更要求在微创的情况下获得根治，保证术后病人有良好的生活质量，所以精准的早期诊断使其治疗手段也更趋于个体化。目前在我国早期胃癌的诊断率仍不足10％，而日本则高达50％～70％，开发胃癌早期诊断方法，提高早期胃癌的诊断率，使胃癌病人能够早期得到合适的治疗，是当前从事胃癌诊断产品开发企业的重要任务。目前，在包括体液如血液、尿液、唾液、支气管液、痰液、腹膜灌洗液和粪便等提取物在内的生物标本中的特异性癌症相关标记物的鉴定能提供有价值的癌症早期诊断方法，以便早期治疗并改善预后。特异性癌症标记物还能提供用于监测疾病进展的方法，从而能跟踪外科手术、放射治疗和化学治疗的功效。然而，对于许多主要癌症，可利用的标记物缺乏足够的敏感性和特异性。例如，用于胃癌的最常用标记物CA19-9、CA72-4和癌胚抗原(CEA)仅检测到大约15-50％的任何阶段的胃肿瘤，对于疾病早期的检测则降至大约2-11％。因此，出现假阴性检测的频率非常高，这导致患者和健康护理工作者认为不存在疾病，而事实上，患者可能患有严重的需要立即注意的癌症。而且，使用这些标记物可能对高达1/3的患有良性胃疾病个体给出假阳性信号。因此，有效的胃癌早期诊断生物标志物是迫切需要的。在散发性胃癌的发病中，表遗传学改变比遗传学改变占有更重要的地位。近20年的研究发现，作为表遗传学的重要组成部分，表观遗传学(epigenetics)是研究转录前基因在染色质水平的结构修饰对基因功能的影响，这种修饰可通过细胞分裂和增殖周期进行传递，并适当的调控基因转录表达，以保证细胞进行正常的增殖-分化-成熟-衰老的发育进程。长期以来，人们一直认为肿瘤的发生是基因突变累积的结果，然而近年随着表观遗传学的研究进展，已越来越清楚地发现表观遗传机制在肿瘤的发生中起着非常重要的作用。表观遗传修饰包括DNA甲基化修饰、组蛋白修饰和染色体印迹等。而DNA甲基化是肿瘤中最常见的分子改变之一，CpG岛甲基化导致抑癌基因失活是引起细胞恶化的重要步骤。以种系特异性基因为例：体细胞中需要保持永久关闭的关键基因在胚胎干细胞中被甲基化，然而一旦甲基化丢失则将导致细胞的去分化，并向着肿瘤相关的表型发展，如果抑癌基因再发生高甲基化或/和基因突变，则导致肿瘤的形成。DNA甲基化改变调控基因表达、与肿瘤的发生发展密切相关的概念是人类基因组计划完成之后，表观遗传学研究的一个重要的成果。DNA甲基化是基因表达调控的一种中间形式，最可能的调控作用是通过抑制关键基因的表达，从而决定该细胞的命运，如对于肿瘤细胞中DNA甲基化异常现象的研究已经在多种肿瘤中取得了许多重大的进展。哺乳动物中，甲基化仅影响DNA链上鸟嘌呤前的胞嘧啶(CpG)。正常细胞中CpG双核苷酸的甲基化分布并不均一，大约50％的基因在启动子区域有CpG集中分布的CpG岛存在，长度从0.5～2kb不等，该区域与基因的转录调控有着密切关系。人体某些基因调控区域的CpG岛甲基化在相关癌细胞组织中频繁出现，显示出与某些肿瘤的发病、病程进展和预后、用药敏感性等相关。迄今为止，已在大多数人类肿瘤中发现了基因甲基化异常。研究发现在癌细胞中表观遗传编码发生紊乱，首先表现在DNA甲基化水平紊乱，又称为甲基化重排，即促进增殖的基因低甲基化、高表达；促进细胞分化的基因高甲基化、低表达；DNA甲基化转移酶家族(DNMTfamily)高表达。癌症中甲基化重排涉及的基因包括：细胞周期调控基因、DNA修复基因、血管形成基因、细胞凋亡相关基因、细胞黏附迁移相关基因、激素受体基因、核转录因子、酶类等等。通过对DNA甲基化修饰的研究，有可能为肿瘤发病机制的阐明、肿瘤早期诊断和治疗开辟新的有效途径，达到肿瘤治疗的目的。由于CpG岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生，因此，甲基化的诊断可以用于肿瘤发生的早期预测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测p16、CDH1、MGMT、RARB和RNF180基因及其片段的甲基化的试剂盒，包括引物探针组合物甲、引物探针组合物乙、引物探针组合物丙、引物探针组合物丁和引物探针组合物戊；引物探针组合物甲包括特异性引物对甲、封闭引物甲和探针甲；引物探针组合物乙包括特异性引物对乙、封闭引物乙和探针乙；引物探针组合物丙包括特异性引物对丙、封闭引物丙和探针丙；引物探针组合物丁包括特异性引物对丁、封闭引物丁和探针丁；引物探针组合物戊包括特异性引物对戊、封闭引物戊和探针戊；引物探针组合物甲为第一引物探针组合物甲或第二引物探针组合物甲；第一引物探针组合物甲中：特异性引物对甲为序列表的序列6所示DNA和序列表的序列7所示DNA组成的引物对，封闭引物甲的核苷酸序列如序列表的序列8所示，探针甲的核苷酸序列如序列表的序列9所示；第二引物探针组合物甲中：特异性引物对甲为序列表的序列10所示DNA和序列表的序列11所示DNA组成的引物对，封闭引物甲的核苷酸序列如序列表的序列12所示，探针甲的核苷酸序列如序列表的序列13所示；引物探针组合物乙为第三引物探针组合物乙或第四引物探针组合物乙；第三引物探针组合物乙中：特异性引物对乙为序列表的序列14所示DNA和序列表的序列15所示DNA组成的引物对，封闭引物乙的核苷酸序列如序列表的序列16所示，探针乙的核苷酸序列如序列表的序列17所示；第四引物探针组合物乙中：特异性引物对乙为序列表的序列18所示DNA和序列表的序列19所示DNA组成的引物对，封闭引物乙的核苷酸序列如序列表的序列20所示，探针乙的核苷酸序列如序列表的序列21所示；引物探针组合物丙为第五引物探针组合物丙或第六引物探针组合物丙；第五引物探针组合物丙中：特异性引物对丙为序列表的序列22所示DNA和序列表的序列23所示DNA组成的引物对，封闭引物丙的核苷酸序列如序列表的序列24所示，探针丙的核苷酸序列如序列表的序列25所示；第六引物探针组合物丙中：特异性引物对丙为序列表的序列26所示DNA和序列表的序列27所示DNA组成的引物对，封闭引物丙的核苷酸序列如序列表的序列28所示，探针丙的核苷酸序列如序列表的序列29所示；引物探针组合物丁为第七引物探针组合物丁或第八引物探针组合物丁；第七引物探针组合物丁中：特异性引物对丁为序列表的序列30所示DNA和序列表的序列31所示DNA组成的引物对，封闭引物丁的核苷酸序列如序列表的序列32所示，探针丁的核苷酸序列如序列表的序列33所示；第八引物探针组合物丁中：特异性引物对丁为序列表的序列34所示DNA和序列表的序列35所示DNA组成的引物对，封闭引物丁的核苷酸序列如序列表的序列36所示，探针丁的核苷酸序列如序本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测p16、CDH1、MGMT、RARB和RNF180基因及其片段的甲基化的试剂盒，其特征在于：包括引物探针组合物甲、引物探针组合物乙、引物探针组合物丙、引物探针组合物丁和引物探针组合物戊；所述引物探针组合物甲包括特异性引物对甲、封闭引物甲和探针甲；所述引物探针组合物乙包括特异性引物对乙、封闭引物乙和探针乙；所述引物探针组合物丙包括特异性引物对丙、封闭引物丙和探针丙；所述引物探针组合物丁包括特异性引物对丁、封闭引物丁和探针丁；所述引物探针组合物戊包括特异性引物对戊、封闭引物戊和探针戊；所述引物探针组合物甲为第一引物探针组合物甲或第二引物探针组合物甲；所述第一引物探针组合物甲中：所述特异性引物对甲为序列表的序列6所示DNA和序列表的序列7所示DNA组成的引物对，所述封闭引物甲的核苷酸序列如序列表的序列8所示，所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列9所示；所述第二引物探针组合物甲中：所述特异性引物对甲为序列表的序列10所示DNA和序列表的序列11所示DNA组成的引物对，所述封闭引物甲的核苷酸序列如序列表的序列12所示，所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列13所示；所述引物探针组合物乙为第三引物探针组合物乙或第四引物探针组合物乙；所述第三引物探针组合物乙中：所述特异性引物对乙为序列表的序列14所示DNA和序列表的序列15所示DNA组成的引物对，所述封闭引物乙的核苷酸序列如序列表的序列16所示，所述探针乙的核苷酸序列如序列表的序列17所示；所述第四引物探针组合物乙中：所述特异性引物对乙为序列表的序列18所示DNA和序列表的序列19所示DNA组成的引物对，所述封闭引物乙的核苷酸序列如序列表的序列20所示，所述探针乙的核苷酸序列如序列表的序列21所示；所述引物探针组合物丙为第五引物探针组合物丙或第六引物探针组合物丙；所述第五引物探针组合物丙中：所述特异性引物对丙为序列表的序列22所示DNA和序列表的序列23所示DNA组成的引物对，所述封闭引物丙的核苷酸序列如序列表的序列24所示，所述探针丙的核苷酸序列如序列表的序列25所示；所述第六引物探针组合物丙中：所述特异性引物对丙为序列表的序列26所示DNA和序列表的序列27所示DNA组成的引物对，所述封闭引物丙的核苷酸序列如序列表的序列28所示，所述探针丙的核苷酸序列如序列表的序列29所示；所述引物探针组合物丁为第七引物探针组合物丁或第八引物探针组合物丁；所述第七引物探针组合物丁中：所述特异性引物对丁为序列表的序列30所示DNA和序列表的序列31所示DNA组成的引物对，所述封闭引物丁的核苷酸序列如序列表的序列32所示，所述探针丁的核苷酸序列如序列表的序列33所示；所述第八引物探针组合物丁中：所述特异性引物对丁为序列表的序列34所示DNA和序列表的序列35所示DNA组成的引物对，所述封闭引物丁的核苷酸序列如序列表的序列36所示，所述探针丁的核苷酸序列如序列表的序列37所示；所述引物探针组合物戊为第九引物探针组合物戊或第十引物探针组合物戊；所述第九引物探针组合物戊中：所述特异性引物对戊为序列表的序列38所示DNA和序列表的序列39所示DNA组成的引物对，所述封闭引物戊的核苷酸序列如序列表的序列40所示，所述探针戊的核苷酸序列如序列表的序列41所示；所述第十引物探针组合物戊中：所述特异性引物对戊为序列表的序列42所示DNA和序列表的序列43所示DNA组成的引物对，所述封闭引物戊的核苷酸序列如序列表的序列44所示，所述探针戊的核苷酸序列如序列表的序列45所示。...

【技术特征摘要】
1.一种检测p16、CDH1、MGMT、RARB和RNF180基因及其片段的甲基化的试剂盒，其特征在于：包括引物探针组合物甲、引物探针组合物乙、引物探针组合物丙、引物探针组合物丁和引物探针组合物戊；所述引物探针组合物甲包括特异性引物对甲、封闭引物甲和探针甲；所述引物探针组合物乙包括特异性引物对乙、封闭引物乙和探针乙；所述引物探针组合物丙包括特异性引物对丙、封闭引物丙和探针丙；所述引物探针组合物丁包括特异性引物对丁、封闭引物丁和探针丁；所述引物探针组合物戊包括特异性引物对戊、封闭引物戊和探针戊；所述引物探针组合物甲为第一引物探针组合物甲或第二引物探针组合物甲；所述第一引物探针组合物甲中：所述特异性引物对甲为序列表的序列6所示DNA和序列表的序列7所示DNA组成的引物对，所述封闭引物甲的核苷酸序列如序列表的序列8所示，所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列9所示；所述第二引物探针组合物甲中：所述特异性引物对甲为序列表的序列10所示DNA和序列表的序列11所示DNA组成的引物对，所述封闭引物甲的核苷酸序列如序列表的序列12所示，所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列13所示；所述引物探针组合物乙为第三引物探针组合物乙或第四引物探针组合物乙；所述第三引物探针组合物乙中：所述特异性引物对乙为序列表的序列14所示DNA和序列表的序列15所示DNA组成的引物对，所述封闭引物乙的核苷酸序列如序列表的序列16所示，所述探针乙的核苷酸序列如序列表的序列17所示；所述第四引物探针组合物乙中：所述特异性引物对乙为序列表的序列18所示DNA和序列表的序列19所示DNA组成的引物对，所述封闭引物乙的核苷酸序列如序列表的序列20所示，所述探针乙的核苷酸序列如序列表的序列21所示；所述引物探针组合物丙为第五引物探针组合物丙或第六引物探针组合物丙；所述第五引物探针组合物丙中：所述特异性引物对丙为序列表的序列22所示DNA和序列表的序列23所示DNA组成的引物对，所述封闭引物丙的核苷酸序列如序列表的序列24所示，所述探针丙的核苷酸序列如序列表的序列25所示；所述第六引物探针组合物丙中：所述特异性引物对丙为序列表的序列26所示DNA和序列表的序列27所示DNA组成的引物对，所述封闭引物丙的核苷酸序列如序列表的序列28所示，所述探针丙的核苷酸序列如序列表的序列29所示；所述引物探针组合物丁为第七引物探针组合物丁或第八引物探针组合物丁；所述第七引物探针组合物丁中：所述特异性引物对丁为序列表的序列30所示DNA和序列表的序列31所示DNA组成的引物对，所述封闭引物丁的核苷酸序列如序列表的序列32所示，所述探针丁的核苷酸序列如序列表的序列33所示；所述第八引物探针组合物丁中：所述特异性引物对丁为序列表的序列34所示DNA和序列表的序列35所示DNA组成的引物对，所述封闭引物丁的核苷酸序列如序列表的序列36所示，所述探针丁的核苷酸序列如序列表的序列37所示；所述引物探针组合物戊为第九引物探针组合物戊或第十引物探针组合物戊；所述第九引物探针组合物戊中：所述特异性引物对戊为序列表的序列38所示DNA和序列表的序列39所示DNA组成的引物对，所述封闭引物戊的核苷酸序列如序列表的序列40所示，所述探针戊的核苷酸序列如序列表的序列41所示；所述第十引物探针组合物戊中：所述特异性引物对戊为序列表的序列42所示DNA和序列表的序列43所示DNA组成的引物对，所述封闭引物戊的核苷酸序列如序列表的序列44所示，所述探针戊的核苷酸序列如序列表的序列45所示。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：还包括针对内参基因的内参引物和内参探针，所述内参基因为ACTB和/或GSTP1。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述内参基因ACTB的内参引物对为序列表的序列46所示DNA和序列表的序列47所示DNA组成的引物对；所述内参基因ACTB的内参探针的核苷酸序列如序列表的序列48所示；所述内参基因GSTP1的内参引物对为序列表的序列49所示DNA和序列表的序列50所示DNA组成的引物对；所述内参基因GSTP1的内参探针的核苷酸序列如序列表的序列51所示。4.一种用于诊断胃癌患者的试剂盒，其特征在于，包括如下五个引物探针组合物中的至少一种：引物探针组合物甲、引物探针组合物乙、引物探针组合物丙、引物探针组合物丁和引物探针组合物戊；所述引物探针组合物甲包括特异性引物对甲、封闭引物甲和探针甲；所述引物探针组合物乙包括特异性引物对乙、封闭引物乙和探针乙；所述引物探针组合物丙包括特异性引物对丙、封闭引物丙和探针丙；所述引物探针组合物丁包括特异性引物对丁、封闭引物丁和探针丁；所述引物探针组合物戊包括特异性引物对戊、封闭引物戊和探针戊；所述引物探针组合物甲为第一引物探针组合物甲或第二引物探针组合物甲；所述第一引物探针组合物甲中：所述特异性引物对甲为序列表的序列6所示DNA和序列表的序列7所示DNA组成的引物对，所述封闭引物甲的核苷酸序列如序列表的序列8所示，所述探针甲的核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明明，索伟克，蒲珏，
申请(专利权)人：北京艾克伦医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11