一种人类肿瘤基因变异联合检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种人类肿瘤基因变异联合检测试剂盒，包括以下部分：EGFR基因引物组、KRAS基因引物组、BRAF基因引物组、NRAS基因引物组、PIK3CA基因引物组、HiFi酶、PCR反应液、消化酶、连接酶、连接缓冲液、连接接头、荧光探针、QPCR反应的Taq酶、QPCR引物和QPCR反应液。本发明专利技术提供的联合检测试剂盒能同时检测人类肿瘤的多种驱动基因的突变位点，包括EGFR、NRAS、KRAS、PIK3CA和BRAF中一个或多个基因突变位点，使实验结果灵敏度高，可以检测出1％的突变率，大大提高了检测灵敏度，克服了现有技术中的难题，同时整个实验过程满足大批量、快速检测的要求。

Human tumor gene mutation combined detection kit

The invention provides a human tumor gene mutation combined detection kit, including the following parts: the primer of EGFR gene group, KRAS gene primer pairs, BRAF gene primer pairs, NRAS gene primer pairs, PIK3CA gene primer group, HiFi enzyme, PCR reaction liquid, digestive enzyme, DNA ligase, connection buffer, connector, fluorescence the reaction of QPCR probe, Taq enzyme, QPCR primers and QPCR reaction liquid. The joint test kit provided by the invention can simultaneously detect various human tumor driven mutation genes, including one or more mutations of EGFR, NRAS, KRAS, PIK3CA and BRAF loci, the experimental results of high sensitivity, can detect the mutation rate of 1%, greatly improve the detection sensitivity and overcome the problem in the prior art, and the whole experiment process to meet the rapid detection of large quantities and requirements.

【技术实现步骤摘要】
一种人类肿瘤基因变异联合检测试剂盒
本专利技术涉及基因变异检测领域，尤其涉及一种人类肿瘤基因变异联合检测试剂盒。
技术介绍
肺癌是世界上常见的癌症，发病率和死亡率居各癌症之首。2002年全世界肺癌的新发病率为138万，近一半发生在发展中国家。据2008年我国卫生部的统计，肺癌死亡率为30.83/10万。肺癌已经成为发病率和死亡率第一位的恶性肿瘤，肺癌的死亡例数远大于乳腺癌和前列腺癌死亡例数的总和。肺癌从组织病理学上可以分为两大类：小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌约占所有肺癌病例数85％，包括鳞癌、腺癌和大细胞癌。发达国家的肺癌患者的5年生存率为15％～20％，而我国肺癌患者5年生存率仅为10％。其主要原因是大多数肺癌由于缺乏高灵敏度的基因突变检测和确诊技术，以及相匹配的科学治疗方案，从而失去了治疗的最佳时机。因此，肺癌的基因突变检测和诊断技术，对于与之匹配的科学有效的化疗方案，提高肺癌患者的生存率，延长生存期有着重大的现实意义。肺癌的发生主要由于致癌环境下，驱动基因的突变，导致突变细胞过度增殖而形成。肺癌的驱动性基因突变是一种恶性的基因突变，是导致肺癌发生、增殖、转移和耐药的最根本原因。美国国立癌症研究所的肺癌突变联盟组织14家研究单位，对1000例的肺腺癌的驱动突变进行检测。结果显示约60％的患者含有驱动性基因突变。进一步表明了检测肺癌驱动性突变对于肺癌的早期诊断和化疗靶向用药的预后提供重要的中间信息。同时，肺癌的驱动性突变的检测是肺癌靶向药物的开发和用药的前提和基础。目前常见的检测这些基因突变的方法主要有sanger测序法和荧光定量法。Sanger测序法中，单对引物可检测多个突变，但对多个基因、或同一基因的不同外显子的突变位点就需要分别进行扩增测序，操作繁琐，并且灵敏度较低约20％，假阳性率较高。荧光定量PCR法虽然灵敏度高，但对每对引物只能检测一种突变，且每种突变需要单独建立一个PCR体系，同时检测多个突变位点的操作繁琐。这两种方法对样本的需要量都较大，不适合同时检测多个基因突变位点。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种人类肿瘤基因变异联合检测试剂盒，可同时检测多个基因的不同的突变位点，同时具有检测灵敏度高，重复性好的特点。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种人类肿瘤基因变异联合检测试剂盒，包括以下部分：EGFR基因引物组、KRAS基因引物组、BRAF基因引物组、NRAS基因引物组、PIK3CA基因引物组、HiFi酶、PCR反应液、消化酶、连接酶、连接缓冲液、连接接头、荧光探针、QPCR反应的Taq酶、QPCR引物和QPCR反应液；所述EGFR基因引物组包括4对引物，所述EGFR基因引物的核酸序列如SeqIDNo1～SeqIDNo8所示；所述BRAF基因引物组包括1对引物；所述BRAF基因引物的核酸序列如SeqIDNo9～SeqIDNo10所示；所述基因NRAS引物组包括2对引物，所述NRAS基因引物的核酸序列如SeqIDNo11～SeqIDNo14所示；所述基因KRAS引物组包括2对引物，所述KRAS基因引物的核酸序列如SeqIDNo15～SeqIDNo16所示；所述PIK3CA基因引物组包括2对引物，所述PIK3CA基因引物的核酸序列如SeqIDNo17～SeqIDNo20所示。优选的，荧光探针的核苷酸序列如SeqIDNo21所示。优选的，QPCR引物的核苷酸序列如SeqIDNo22～SeqIDNo23所示。优选的，连接接头的核苷酸序列如SeqIDNo24～SeqIDNo33所示。优选的，所述消化酶为磷酸二酯酶；所述磷酸二酯酶的酶活力为5U/μL。优选的，所述连接酶为T4连接酶；所述T4连接酶的酶活力为1U/μL。优选的，所述PCR反应液包含下列含量的组分：10mmol/L的dNTP混合物的5×扩增酶反应液；所述5×扩增酶反应液包含以下含量组分：成分浓度Tris-HCl(pH9.2)250mmol/LKCl249mmol/LMgCl28mmol/L甘油50％优选的，所述QPCR反应液包含下列含量的组分：包含10mmol/L的dNTP混合物的5×扩增酶反应液；所述5×扩增酶反应液包含以下含量组分：成分浓度Tris-HCl(pH8.2)250mmol/LKCl249mmol/LMgCl28mmol/L甘油50％优选的，所述HiFi酶的酶活力为5U/μL。本专利技术还提供了所述的试剂盒在检测基因EGFR、KRAS、BRAF、NRAS和PIK3CA中一个和多个基因突变中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种人类肿瘤基因变异联合检测试剂盒，包括以下部分：EGFR基因引物组、KRAS基因引物组、BRAF基因引物组、NRAS基因引物组、PIK3CA基因引物组、HiFi酶、PCR反应液、消化酶、连接酶、连接缓冲液、连接接头、荧光探针、QPCR反应的Taq酶、QPCR引物和QPCR反应液；所述EGFR基因引物组包括4对引物，所述EGFR基因引物的核酸序列如SeqIDNo1～SeqIDNo8所示；所述BRAF基因引物组包括1对引物；所述BRAF基因引物的核酸序列如SeqIDNo9～SeqIDNo10所示；所述基因NRAS引物组包括2对引物，所述NRAS基因引物的核酸序列如SeqIDNo11～SeqIDNo14所示；所述基因KRAS引物组包括2对引物，所述KRAS基因引物的核酸序列如SeqIDNo15～SeqIDNo16所示；所述PIK3CA基因引物组包括2对引物，所述PIK3CA基因引物的核酸序列如SeqIDNo17～SeqIDNo20所示。本专利技术提供的联合检测试剂盒能同时检测人类肿瘤的多种驱动基因的突变位点，包括EGFR、NRAS、KRAS、PIK3CA和/或BRAF基因的多个突变位点，使实验结果灵敏度高，可以检测出1％的突变率，大大提高了检测灵敏度，克服了现有技术中的难题。同时，本专利技术提供的试剂盒通过连接接头的应用，使得一次检测可以同时检测几十个甚至几百个样本，使整个实验过程简单，快速，成本低；另外所述试剂盒对每个样本的需求量低，每个样本只需要10～100ngDNA即可。本专利技术提供的试剂盒对驱动性突变基因的检测提供了有效手段。附图说明图1为实施例1中文库构建流程图；图2为实施例1中IonTorrentProton测序结果。具体实施方式本专利技术提供了一种人类肿瘤基因变异联合检测试剂盒，包括以下部分：EGFR基因引物组、KRAS基因引物组、BRAF基因引物组、NRAS基因引物组、PIK3CA基因引物组、HiFi酶、PCR反应液、消化酶、连接酶、连接缓冲液、连接接头、荧光探针、QPCR反应的Taq酶、QPCR引物和QPCR反应液；所述EGFR基因引物组包括4对引物，所述EGFR基因引物的核酸序列如SeqIDNo1～SeqIDNo8所示；所述BRAF基因引物组包括1对引物；所述BRAF基因引物的核酸序列如SeqIDNo9～SeqIDNo10所示；所述基因NRAS引物组包括2对引物，所述NRAS基因引物的核酸序列如SeqIDNo11～SeqIDNo14所示；所述基因KRAS引物组包括2对引物，所述KRAS基因引物的核酸序列如SeqIDNo15～SeqIDNo16所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人类肿瘤基因变异联合检测试剂盒，其特征在于，包括以下部分：EGFR基因引物组、KRAS基因引物组、BRAF基因引物组、NRAS基因引物组、PIK3CA基因引物组、HiFi酶、PCR反应液、消化酶、连接酶、连接缓冲液、连接接头、荧光探针、QPCR反应的Taq酶、QPCR引物和QPCR反应液；所述EGFR基因引物组包括4对引物，所述EGFR基因引物的核酸序列如Seq ID No 1～Seq ID No 8所示；所述BRAF基因引物组包括1对引物；所述BRAF基因引物的核酸序列如Seq ID No 9～Seq ID No 10所示；所述基因NRAS引物组包括2对引物，所述NRAS基因引物的核酸序列如Seq ID No 11～SeqID No 14所示；所述基因KRAS引物组包括2对引物，所述KRAS基因引物的核酸序列如Seq ID No 15～Seq ID No 16所示；所述PIK3CA基因引物组包括2对引物，所述PIK3CA基因引物的核酸序列如Seq IDNo 17～Seq IDNo 20所示。

【技术特征摘要】
1.一种人类肿瘤基因变异联合检测试剂盒，其特征在于，包括以下部分：EGFR基因引物组、KRAS基因引物组、BRAF基因引物组、NRAS基因引物组、PIK3CA基因引物组、HiFi酶、PCR反应液、消化酶、连接酶、连接缓冲液、连接接头、荧光探针、QPCR反应的Taq酶、QPCR引物和QPCR反应液；所述EGFR基因引物组包括4对引物，所述EGFR基因引物的核酸序列如SeqIDNo1～SeqIDNo8所示；所述BRAF基因引物组包括1对引物；所述BRAF基因引物的核酸序列如SeqIDNo9～SeqIDNo10所示；所述基因NRAS引物组包括2对引物，所述NRAS基因引物的核酸序列如SeqIDNo11～SeqIDNo14所示；所述基因KRAS引物组包括2对引物，所述KRAS基因引物的核酸序列如SeqIDNo15～SeqIDNo16所示；所述PIK3CA基因引物组包括2对引物，所述PIK3CA基因引物的核酸序列如SeqIDNo17～SeqIDNo20所示。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，荧光探针的核苷酸序列如SeqIDNo21所示。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，QPCR引物的核苷酸序列如SeqIDNo22～SeqIDNo23所示。4.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈成，陈悦科，朱凯，刘璐，
申请(专利权)人：上海鼎晶生物医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31