一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测试剂盒及其应用制造技术

脊髓性肌萎缩症是一种常见的神经系统遗传疾病，本发明专利技术提供了一种该病相关SMN1基因的检测试剂盒及其应用。试剂盒中包括SMN1基因7号外显子的特异性扩增引物对和3个内参基因的扩增引物对，其中上游引物的5’端均标记了荧光基团FAM，通过常规PCR反应和片段分析即可实现对SMN1基因突变的检测：不仅可以检测SMN1基因纯合缺失情况，还能检测SMN1基因拷贝数变异情况，并且检测结果不受SMN2基因影响。与现有检测试剂盒相比，本发明专利技术试剂盒的检测结果同样准确可靠，然而检测却更加简便快速、检测成本更加低廉，可以更好满足临床低成本高通量的检测需求。

Spinal muscular atrophy related gene mutation detection kit and application thereof

Spinal muscular atrophy is a common genetic disease of the nervous system. The present invention provides a kit for detecting the related SMN1 gene of the disease and its application. Primers for exon 7 of SMN1 gene including kit specific primers and 3 reference genes for the upstream primer, 5 'end labeled fluorophores FAM by conventional PCR reaction and fragment analysis can realize the detection of SMN1 gene mutation: not only to detect homozygous SMN1 gene the lack of copy number variation can detect the SMN1 gene, and the detection result is not affected by the effects of SMN2 gene. Compared with the existing detection kit, the detection kit of the invention of the same accuracy, but the detection is more simple and rapid detection, low cost, can better meet the clinical demand of low cost and high throughput detection.

【技术实现步骤摘要】
一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测试剂及其应用。
技术介绍
脊髓性肌萎缩症(SpinalMuscularAtrophy,SMA)是由脊髓前角变性引起肢体肌无力和肌萎缩症状的常染色体隐性遗传疾病，运动神经元生存(SurvivalMotorNeuron,SMN)基因是其致病基因。这是种常见的神经系统遗传疾病，其发病率为1/10000-1/6000，携带者频率为1/60-1/40，主要的临床表现为进行性、对称性肢体无力及肌萎缩，近端重于远端，面肌和眼外肌不受累；具有很高的致死率，目前尚无有效的治疗方案。由于SMA的临床表现、血液检查、电生理检查与病理检查均无明显特异性，导致很难将其与其它运动神经元病与肌营养不良症相区别，因此SMN基因突变检测是SMA的主要判别方法。SMN基因位于5号染色体长臂1区3带2亚带(5q13.2)上，该区域内结构复杂，存在的重复序列及众多假基因簇导致其结构不稳定。此外，SMN基因存在2个高度同源性拷贝，分别为端粒侧SMN1和着丝粒侧SMN2，SMN1缺失是引起脊髓性肌萎缩的主要原因(约占95％)，其余则呈SMN1基因微小突变；然而由于二者仅存在5个碱基差异，其中有2个碱基位于第7和8号外显子，故给SMN1基因的检测带来一定的困难。目前临床上对SMA常规基因检测主要采用荷兰MRC公司的多重连接探针扩增(MultipleLigation-dependentProbeAmplification，MLPA)检测试剂盒。对应方法利用杂合、连接和PCR扩增反应，可于单一反应管内同时检测SMN1和SMN2拷贝数的变化，然而进口试剂盒成本昂贵且需要特定的分析仪器，此外检测周期长(约24小时)。因此，亟需开发一款准确可靠、简便经济的检测试剂盒，便于临床推广和应用。
技术实现思路
针对现有SMA相关基因检测技术存在的不足，本专利技术提供了一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测试剂盒及其应用。试剂盒中同时含有SMN1基因特异性引物和3个内参基因引物，其中上游引物的5’端均标记了荧光基团，通过常规PCR反应和片段分析即可实现对SMN1基因突变的检测；检测结果快速准确、检测成本低廉，适合于临床推广和应用。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案如下：本专利技术试剂盒包括特异性扩增SMN1基因7号外显子的引物对FSMN1.7-RSMN1.7，3个内参基因的扩增引物对FIC1-RIC1、FIC2-RIC2、FIC3-RIC3，其中引物FSMN1.7、FIC1、FIC2、FIC3的5’端均标记荧光基团FAM(羧基荧光素)。各引物的序列为：FSMN1.7：5'-CTTTATTTTCCTTACAGGGTTTC-3'(SEQNO.1)，RSMN1.7：5'-GTGAAAGTATGTTTCTTCCACGT-3'(SEQNO.2)；FIC1：5'-TTCATTGACATGCCAACAGAAG-3'(SEQNO.3)，RIC1：5'-GCAAGCAGTGTTCAAATCTCAC-3'(SEQNO.4)；FIC2：5'-GTAGTCTGTGATCTCCGTTTAG-3'(SEQNO.5)，RIC2：5'-TGTGCATCACCACTGTACCTG-3'(SEQNO.6)；FIC3：5'-CGAATGGCTACTTCTACCTG-3'(SEQNO.7)，RIC3：5'-AAACGTCTTTTAAATCAGAGC-3'(SEQNO.8)。试剂盒详细组份如下：表1本专利技术试剂盒组分表1组分中，DNA聚合酶、PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs均采用常规用于PCR反应的商业化试剂，其中DNA聚合酶活力单位浓度≥5U/uL，具有耐热性能；PCR缓冲液是与购置的DNA聚合酶配套的PCR缓冲液；MgCl2的浓度为25mmol/L；dNTPs是由dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2.5mmol/L混合而成的；8条引物的合成和修饰均由商业化公司完成，为冻干粉，使用时建议加无菌水配制成10umol/L；正常基因型样本的基因组DNA当成对照，从健康人的样本获取，浓度不低于50ng/ul。将本专利技术试剂盒应用于SMN1基因突变检测，主要步骤如下：(1)荧光短片段的多重PCR扩增提取检测对象基因组DNA并以其为模板，采用FSMN1.7-RSMN1.7和FIC1-RIC1、FIC2-RIC2、FIC3-RIC3混合扩增体系在同一PCR管内进行多重PCR，特异性扩增SMN1基因7号外显子和3个内参基因。(2)基因分析仪分析多重PCR产物利用基因分析仪获取多重PCR产物的荧光峰形图，将SMN1基因片段峰面积除以3个内参基因片段峰面积和，即得到该目的片段的相对峰面积(Relativepeakarea,RPA)；再将检测组的RPA与正常基因型对照的RPA相比，即为拷贝数比值，进而可计算出该目的片段的拷贝数。其中，步骤(1)中混合扩增体系如下表2所示：表2扩增体系体系组成终浓度或添加量PCRBuffer1×MgCl21uldNTPs1ul2条SMN1引物1.5ul/条6条内参引物1ul/条Taq酶0.25ul基因组DNA20-100ng灭菌超纯水补足至25ul其中，步骤(1)中多重PCR的扩增条件为：96℃3min；96℃30s，58℃30s，72℃30s，23个循环；72℃10min。其中，步骤(2)中数据分析可以参照文献(CastellsaguéE,etal.，DetectionofAPCgenedeletionsusingquantitativemultiplexPCRofshortfluorescentfragments[J].ClinChem,2008,54(7):1132-1140.)进行.其中，步骤(2)中拷贝数比值结果判定如表3所示：表3拷贝数比值判读本专利技术的有益效果是，试剂盒含有的FSMN1.7-RSMN1.7引物对为自主设计，能特异性扩增SMN1基因，检测结果不受SMN2基因影响；此外不仅可以检测SMN1基因纯合缺失情况，还能检测SMN1基因拷贝数变异情况。与现有检测试剂盒相比，本专利技术试剂盒的检测结果一样准确可靠，然而检测更加简便快速，检测成本更加低廉，可以更好满足临床低成本高通量的检测需求。附图说明图1是SMN1基因7号外显子正常检测结果图。其中，3为SMN1基因7号外显子扩增片段的信号峰，1、2、4为3个内参扩增片段的信号峰，横坐标是每个片段的位置，纵坐标是每个片段对应的信号峰高。图2是SMN1基因7号外显子缺失检测结果图。其中，3为SMN1基因7号外显子扩增片段的信号峰，1、2、4为3个内参扩增片段的信号峰，横坐标是每个片段的位置，纵坐标是每个片段对应的信号峰高。图3是SMN1基因7号外显子杂合缺失检测结果图。其中，3为SMN1基因7号外显子扩增片段的信号峰，1、2、4为3个内参扩增片段的信号峰，横坐标是每个片段的位置，纵坐标是每个片段对应的信号峰高。具体实施方式为了更好的理解本
技术实现思路
，下面结合试剂盒检测原理和具体实施例做进一步说明。一、本专利技术试剂盒的检测原理本专利技术试剂盒中含有自主设计的可特异性扩增SMN1基因7号外显子引物对以及3个内参基因引物，在单一PCR管内本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测试剂盒，其特征在于试剂盒包括特异性扩增SMN1基因7号外显子的引物对F

【技术特征摘要】
1.一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测试剂盒，其特征在于试剂盒包括特异性扩增SMN1基因7号外显子的引物对FSMN1.7-RSMN1.7以及3个内参基因的扩增引物对FIC1-RIC1、FIC2-RIC2、FIC3-RIC3，其中引物FSMN1.7、FIC1、FIC2、FIC3的5’端均标记荧光基团FAM；所述各引物的序列为：FSMN1.7：5'-CTTTATTTTCCTTACAGGGTTTC-3'(SEQNO.1)，RSMN1.7：5'-GTGAAAGTATGTTTCTTCCACGT-3'(SEQNO.2)；FIC1：5'-TTCATTGACATGCCAACAGAAG-3'(SEQNO.3)，RIC1：5'-GCAAGCAGTGTTCAAATCTCAC-3'(SEQNO.4)；FIC2：5'-GTAGTCTGTGATCTCCGTTTAG-3'(SEQNO.5)，RIC2：5'-TGTGCATCACCACTGTACCTG-3'(SEQNO.6)；FIC3：5'-CGAATGGCTACTTCTACCTG-3'(SEQNO.7)，RIC3：5'-AAACGTCTTTTAAATCAGAGC-3'(SEQNO.8)。2.根据权利要求1所述的一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括活力≥5U/μL的DNA聚合酶、PCR缓冲液、25mmol/LMgCl2、10mmol/LdNTPs和正常基因型样本的基因组DNA。3.根据权利要求1或2所述的一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测试剂盒，其特征在于将所述试剂盒应用于SMN1基因突变检测，主要步骤如下：(1)荧光短片段的多重PCR扩增：提取检测对象基因组DNA并以其为模板，采用FSM...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈万金，
申请(专利权)人：陈万金，
类型：发明
国别省市：福建,35