一种乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括：DNA提取试剂，PCR反应预混液，热启动Taq酶、UDG酶，阳性质控品，以及阴性质控品，其中，所述PCR反应预混液中具有上游引物：5′-CCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAG-3′，以及下游引物：5′-GGGACTCAAGATGTTGTACAGACTTGG-3′。本发明专利技术的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，(1)检测速度快；(2)特异性好；(3)灵敏度高；能够准确稳定的检测到1％的突变株。(4)重复性好；(5)准确度高；能够准确区分YIDD和YVDD两种突变。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，属于基因检测领域。
技术介绍
我国2006年乙型肝炎流行病学调查表明，我国1-59岁一般人群HBsAg携带率为7.18％，5岁以下儿童的HBsAg仅为0.96％。据此推算，我国现有的慢性乙型肝炎病毒感染者约9300万人，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例。2013年乙型肝炎新增962,974例，占同年病毒性肝炎的76.92％；死亡病例达550例，占同期病毒性肝炎死亡人数的74.42％。乙肝不仅严重影响人民身体健康，而且还造成了重大经济损失。据统计，我国每年因乙肝所致的直接经济损失约300亿～500亿元。同时，由于我国的乙肝患者年龄大多在20～50岁之间，是社会的中坚力量。因此，乙肝的预防与治疗具有重大的社会意义。随着社会进步和人民生活水平的提高，我国政府对乙肝的预防与治疗日益重视，医疗保障体系覆盖率不断扩大，乙肝知晓率和就诊率不断提高，乙肝用药市场保持了快速增长的势头。在各类乙肝用药中，抗病毒类药物市场份额较大，且增长较快。2011～2013年，我国抗病毒类乙肝用药保持着19.90％的复合增长率，2013年市场规模达到132.24亿元。在我国乙肝抗病毒用药市场中，阿德福韦酯、恩替卡韦、拉米夫定等主要药品占有70％左右的市场份额。其中拉米夫定仍是销量较大的一线用药，市场保有量很大。通过抗病毒药物的运用，乙型肝炎病毒已得到有效治疗。但是，长期单一治疗通常不能完全抑制病毒的复制，而会出现耐药突变，拉米夫定耐药是抗病毒药物中最常见发生的耐药突变药物。这种耐药突变主要是YMDD基序上的蛋氨酸(M)被异亮氨酸(I)和缬氨酸(V)替代的结果。当乙型肝炎病毒的YMDD突变为YIDD(204I)或YVDD(204V)时，就会发生拉米夫定耐药。并随治疗时间延长而突变率逐渐增高，一般治疗1年的变异率为24％，2年约38％，治疗3年后变异的发生率49％。而阿德福韦酯、恩替卡韦治疗3年后得变异分别只占到11％和1.2％。耐药一旦发生，将极大降低乙型肝炎病毒对拉米夫定的敏感性，治疗效果显著下降，抗病毒疗效将降低。乙型肝炎病毒的DNA会重新回升，部分患者会出现肝炎急性发作，甚至肝功能失常因此。因此，通过检测YMDD的突变判断乙型肝炎病毒对拉米夫定的敏感性，在指导患者临床用药，监控患者抗病毒疗效方面有重大意义。准确、简便的拉米夫定耐药株检测对慢性乙型肝炎病人的疗程管理十分必要，能为临床用药能提供有力的证据。目前，对乙型肝炎病毒YMDD变异株的基因诊断方法中主要有DNA测序法，PCR-RFLP、聚合酶链反应-酶联免疫吸附法(PCR-ELISA)，基因芯片技术、熔解曲线分析法和实时荧光定量PCR。其中DNA测序法是检测YMDD变异株的金标准，但其操作麻烦，耗时过长。PCR-RFLP和聚合酶链反应-酶联免疫吸附法(PCR-ELISA)虽然能较好的鉴别野生株和变异株，但易产生污染而引起假阳性，另相对于荧光探针分析，在灵敏度及特异性上都有一定差异。基因芯片技术具有高通量、快速、高灵敏等优势但其检测需要昂贵的仪器，专业的配套人员，高昂的价格限制了临床诊断应用。熔解曲线分析法具有快速、方便、经济的特点，但此该法的敏感度和特异性不高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提本专利技术采用了如下技术方案：本专利技术提供一种乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括：DNA提取试剂，PCR反应预混液，热启动Taq酶、UDG酶，阳性质控品，以及阴性质控品，其中，所述PCR反应预混液中具有上游引物：5′-CCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAG-3′，以及下游引物：5′-GGGACTCAAGATGTTGTACAGACTTGG-3′。进一步，本专利技术的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，还可以具有这样的特征：其中，所述DNA提取试剂成分为：莎梵婷，CTAB，乙醇，氯化钾。进一步，本专利技术的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，还可以具有这样的特征：其中，所述PCR反应预混液中具有第一探针：5′-CCCCAATACCACATCATCAATATAACTGAAAGCCAGACAG-3′，其中5′标记FAM基团，3′标记TAMARA基团。进一步，本专利技术的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，还可以具有这样的特征：其中，所述PCR反应预混液中具有第二探针：5′-CCCAATACCACATCATCCACATAACTGAAAGCCAGACAG-3′，其中5′标记CY5基团，3′标记TAMARA基团。进一步，本专利技术的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，还可以具有这样的特征：其中，所述PCR反应预混液中具有第三探针：5′-GCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCAC-3′，其中5′标记ROX基团，3′标记TAMARA基团。进一步，本专利技术的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，还可以具有这样的特征：制备阴性质控品，即野生型YMDD基因时所用的引物为：第一正向引物EWF1：5′-CTGCTCAAGGAACCTCTATGT-3′，第一反向引物EWR1:5′-GACACACTTTCCAATCAATAGG-3′。进一步，本专利技术的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，还可以具有这样的特征：制备阳性质控品中的突变型YIDD基因片段时所用的引物为：第二正向引物EIF1:5′-GGCTTTCAGTTATATTGATGATGTG-3′，第二反向引物EIR1:5′-CACATCATCAATATAACTGAAAGCC-3′。进一步，本专利技术的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，还可以具有这样的特征：制备阳性质控品中的突变型YIDD基因片段时所用的引物为：第三正向引物EVF1:5′-GCTTTCAGTTATGTGGATGATGTG-3′，第三反向引物EVR1:5′-CACATCATCCACATAACTGAAAGC-3′。阳性质控品可采用I/V阳性血清或血浆对照。其为YMDD基因突变体YIDD和YVDD基序中部分核酸片段连接到T载体，加入灭活HBV阴性血清或血浆为基质建立的模拟临床样本。阴性质控品可采用灭活的HBV阴性血清或血浆。专利技术的有益效果本试剂盒和传统的诊断法比较，具有以下优势：(1)检测速度快；(2)特异性好；(3)灵敏度高；能够准确稳定的检测到1％的突变株。(4)重复性好；(5)准确度高；能够准确区分YIDD和YVDD两种突变。具体实施方式下面结合具体实施实例，对本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括：DNA提取试剂，PCR反应预混液，热启动Taq酶、UDG酶，阳性质控品，以及阴性质控品，其中，所述PCR反应预混液中具有上游引物：5′‑CCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAG‑3′，以及下游引物：5′‑GGGACTCAAGATGTTGTACAGACTTGG‑3′。

【技术特征摘要】
1.一种乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括：
DNA提取试剂，PCR反应预混液，热启动Taq酶、UDG酶，阳性质控品，以及阴性质控品，
其中，所述PCR反应预混液中具有上游引物：5′-CCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAG-3′，以
及
下游引物：5′-GGGACTCAAGATGTTGTACAGACTTGG-3′。
2.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，其特征在于：
其中，所述DNA提取试剂成分为：莎梵婷，CTAB，乙醇，氯化钾。
3.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，其特征在于：
其中，所述PCR反应预混液中具有第一探针：5′-
CCCCAATACCACATCATCAATATAACTGAAAGCCAGACAG-3′，其中5′标记FAM基团，3′标记TAMARA基
团。
4.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试剂盒，其特征在于：
其中，所述PCR反应预混液中具有第二探针：5′-
CCCAATACCACATCATCCACATAACTGAAAGCCAGACAG-3′，其中5′标记CY5基团，3′标记TAMARA基
团。
5.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒YMDD基因突变检测试...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘代新，陈静，何胜祥，刘军辉，
申请(专利权)人：上海同科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31