一种减少扩增偏倚的基因突变检测方法和试剂技术

本发明专利技术公开了一种减少扩增偏倚的基因突变检测方法和试剂，所述方法包括：(a)使用第一步单向引导延伸引物对含有目标区域DNA的接头连接产物进行第一步单向引导延伸，然后进行PCR扩增；(b)使用第二步单向引导延伸引物对步骤(a)的产物进行第二步单向引导延伸，然后进行PCR扩增；(c)对步骤(b)的产物进行变性，然后在适于已变性的步骤(b)的产物退火的温度下，用双链特异性核酸酶处理步骤(b)的产物；(d)使用第二通用引物和第三通用引物对(c)的产物进行PCR扩增并测序。本方法能使高丰度DNA含量与低丰度DNA含量接近，达到减少扩增偏倚的目的，实现通过高通量测序技术来低成本精准检测低丰度基因突变的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种减少扩增偏倚的基因突变检测方法和试剂
本专利技术涉及基因检测
，尤其涉及一种减少扩增偏倚的基因突变检测方法和试剂。
技术介绍
基因检测是通过血液、其他体液或细胞对受检者的DNA进行检测的技术。基因检测可以诊断疾病，也可以用于疾病风险的预测。通过基因检测进行疾病早期筛查、疾病诊断、伴随治疗时常常需要对多个低丰度基因突变位点进行准确灵敏的检测。例如，肿瘤是高度异质性的，其中致病突变可能以极低比例存在。实现肿瘤的精准基因检测需要从大量的非肿瘤DNA和非致病突变的肿瘤DNA中找到相关的低丰度基因突变。目前常用的基因检测方法均以PCR(聚合酶链式反应)为基础。PCR扩增为指数扩增，即在扩增的指数期会使PCR产物达到2n倍(n为进入指数期的PCR循环数)。因此PCR扩增会产生扩增偏倚，即原本丰度较高的DNA分子在扩增产物中所占的比例会更大，原有的低丰度DNA分子在扩增产物中所占的比例变得更小。这样就容易出现低丰度DNA分子在PCR产物中被湮没的情况，最终使得检测灵敏度变低，甚至出现某些检测位点假阴性(即无法检测出)的情况。在高通量测序中，PCR扩增偏倚也会导致大量的冗余数据产生，大大增加了测序成本。DSN(Duplex-SpecificNuclease)是一种来自红金蟹的双链特异性核酸酶，具有热稳定性，在60-65℃时具有最大活力。DSN能够高选择性的识别并酶切完全匹配的双链DNA，对单链DNA几乎无作用。在高通量测序平台文库构建的某个时段适当使用DSN核酸酶进行处理可以有效减少PCR扩增产生的偏倚效应。目前现有的减少PCR扩增偏倚的技术解决方案主要是从控制PCR指数期的角度进行的。例如在文库构建过程中尽量减少PCR循环数，未达到指数期或指数期扩增越少产生的扩增偏倚程度就越小。但是减少PCR循环数将直接导致扩增产物得率低，尤其当待检测DNA材料量极少时无法产生足够的PCR产物用于检测，并且低丰度DNA突变很难达到足够的拷贝数以用于检测。另一方案是使用扩增均一度表现优越的DNA聚合酶，此方案只能很小程度上减少扩增偏倚，往往并不能解决实际问题。
技术实现思路
本专利技术提供一种减少扩增偏倚的基因突变检测方法和试剂，能使高丰度DNA含量与低丰度DNA含量接近，达到减少扩增偏倚的目的，最终实现通过高通量测序技术来低成本精准检测低丰度基因突变的目的。根据本专利技术的第一方面，本专利技术提供一种减少扩增偏倚的基因突变检测方法，包括：(a)使用用于捕获待检测位点或待检测区域的第一步单向引导延伸引物对含有目标区域DNA的接头连接产物进行预定循环数的第一步单向引导延伸，然后使用第一通用引物和第一步单向引导延伸引物进行PCR扩增，其中上述第一通用引物与上述接头连接产物上的接头序列匹配；(b)使用用于捕获待检测位点或区域的第二步单向引导延伸引物对上述步骤(a)的产物进行预定循环数的第二步单向引导延伸，其中上述第二步单向引导延伸引物相比上述第一步单向引导延伸引物在模板上的结合位置距离上述待检测位点或区域更近，然后使用第二通用引物和第二步单向引导延伸引物进行PCR扩增，其中上述第二通用引物与上述接头序列匹配；(c)对上述步骤(b)的产物进行变性，然后在适于已变性的上述步骤(b)的产物退火的温度下，用双链特异性核酸酶处理上述步骤(b)的产物，以减少丰度过高的DNA分子含量，增加丰度低的DNA分子的相对含量；(d)使用第二通用引物和第三通用引物对步骤(c)的产物进行PCR扩增并测序。进一步地，上述第一步单向引导延伸引物带有用于捕获上述步骤(a)的产物的亲和标记；优选地，上述亲和标记是位于上述第一步单向引导延伸引物5’端的生物素标记。进一步地，上述第一通用引物与上述第二通用引物是相同的引物。进一步地，上述第一步单向引导延伸引物与上述第二步单向引导延伸引物均位于上述待检测位点或待检测区域在上述目标区域DNA的同方向。进一步地，上述第一步单向引导延伸引物与上述第二步单向引导延伸引物间隔距离是0-110bp，优选间隔距离是55bp。进一步地，有多个上述待检测位点或待检测区域，相应的，使用用于捕获上述多个上述待检测位点或待检测区域的多个第一步单向引导延伸引物和/或多个第二步单向引导延伸引物。进一步地，上述待检测位点或待检测区域包括点突变、插入、缺失和基因融合。进一步地，上述测序包括测序以得到上述待检测位点或待检测区域的基因突变情况。进一步地，上述方法在上述步骤(a)之前还包括：(a’)对上述接头连接产物进行预定循环数的扩增，并以扩增产物替代上述接头连接产物进行上述步骤(a)；优选地，上述预定循环数是3-5个循环。根据本专利技术的第二方面，本专利技术提供一种减少扩增偏倚的基因突变检测试剂，包括：(a)用于捕获待检测位点或待检测区域的第一步单向引导延伸引物，用于对含有目标区域DNA的接头连接产物进行预定循环数的第一步单向引导延伸；和第一通用引物，用于以上述第一步单向引导延伸的产物为模板进行PCR扩增，其中上述第一通用引物与上述接头连接产物上的接头序列匹配；(b)用于捕获待检测位点或区域的第二步单向引导延伸引物，用于对上述第一通用引物的扩增产物进行预定循环数的第二步单向引导延伸，其中上述第二步单向引导延伸引物相比上述第一步单向引导延伸引物在模板上的结合位置距离上述待检测位点或区域更近；和第二通用引物，用于以上述第二步单向引导延伸的产物为模板进行PCR扩增，其中上述第二通用引物与上述接头序列匹配；(c)双链特异性核酸酶，用于在上述第二通用引物的扩增产物已变性且适于退火的温度下，处理上述扩增产物，以减少丰度过高的DNA分子含量，增加丰度低的DNA分子的相对含量；(d)第三通用引物，用于对双链特异性核酸酶处理的产物进行PCR扩增并测序。本专利技术的基因突变检测方法使用单向引导延伸结合DSN核酸酶处理的均一化。PCR前进行数个循环的单向引导延伸，使目标DNA的产物量呈线性增加，即每一个单向引导延伸循环会产生原模板量一倍的单向引导延伸产物。多个单向引导延伸后产生足够的待检测DNA分子，再进行指数PCR扩增，可以相应减少扩增偏倚的程度。DSN核酸酶能够选择性消除高丰度双链DNA，最终使得高丰度DNA含量与低丰度DNA含量接近，进而达到减少扩增偏倚的目的。最终实现通过高通量测序技术来低成本精准检测低丰度基因突变的目的。附图说明图1为本专利技术实施例的第一步单向引导延伸和扩增过程原理示意图；图2为本专利技术实施例的第二步单向引导延伸和扩增过程原理示意图；图3为本专利技术实施例的单向引导延伸及DSN核酸酶去偏倚的效果示意图；图4为本专利技术实施例中纯化文库进行2％琼脂糖凝胶电泳检测的结果图，其中M表示Takara100bpmarker，A表示本专利技术方法文库电泳结果，B表示对照实验的文库电泳结果。图5为本专利技术实施例中各位点与深度比较结果，其中A表示本专利技术方法的各位点的深度情况，B表示对照实验的各位点的深度情况。具体实施方式下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。如图1-2所示，本专利技术实施例的减少扩增偏倚的基因突变检测方法，包括：(a)使用用于捕获待检测位点或待检测区域的第一步单向引导延伸引物对含有目标区域DNA的接头连接产物进行预定循环数的第一步单向引导延伸，然后使用第一通用引物进行PC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种减少扩增偏倚的基因突变检测方法，其特征在于，所述方法包括：(a)使用用于捕获待检测位点或待检测区域的第一步单向引导延伸引物对含有目标区域DNA的接头连接产物进行预定循环数的第一步单向引导延伸，然后使用第一通用引物和第一步单向引导延伸引物进行PCR扩增，其中所述第一通用引物与所述接头连接产物上的接头序列匹配；(b)使用用于捕获待检测位点或区域的第二步单向引导延伸引物对所述步骤(a)的产物进行预定循环数的第二步单向引导延伸，其中所述第二步单向引导延伸引物相比所述第一步单向引导延伸引物在模板上的结合位置距离所述待检测位点或区域更近，然后使用第二通用引物和第二步单向引导延伸引物进行PCR扩增，其中所述第二通用引物与所述接头序列匹配；(c)对所述步骤(b)的产物进行变性，然后在适于已变性的所述步骤(b)的产物退火的温度下，用双链特异性核酸酶处理所述步骤(b)的产物，以减少丰度过高的DNA分子含量，增加丰度低的DNA分子的相对含量；(d)使用第二通用引物和第三通用引物对步骤(c)的产物进行PCR扩增并测序。

【技术特征摘要】
1.一种减少扩增偏倚的基因突变检测方法，其特征在于，所述方法包括：(a)使用用于捕获待检测位点或待检测区域的第一步单向引导延伸引物对含有目标区域DNA的接头连接产物进行预定循环数的第一步单向引导延伸，然后使用第一通用引物和第一步单向引导延伸引物进行PCR扩增，其中所述第一通用引物与所述接头连接产物上的接头序列匹配；(b)使用用于捕获待检测位点或区域的第二步单向引导延伸引物对所述步骤(a)的产物进行预定循环数的第二步单向引导延伸，其中所述第二步单向引导延伸引物相比所述第一步单向引导延伸引物在模板上的结合位置距离所述待检测位点或区域更近，然后使用第二通用引物和第二步单向引导延伸引物进行PCR扩增，其中所述第二通用引物与所述接头序列匹配；(c)对所述步骤(b)的产物进行变性，然后在适于已变性的所述步骤(b)的产物退火的温度下，用双链特异性核酸酶处理所述步骤(b)的产物，以减少丰度过高的DNA分子含量，增加丰度低的DNA分子的相对含量；(d)使用第二通用引物和第三通用引物对步骤(c)的产物进行PCR扩增并测序。2.根据权利要求1所述的减少扩增偏倚的基因突变检测方法，其特征在于，所述第一步单向引导延伸引物带有用于捕获所述步骤(a)的产物的亲和标记；优选地，所述亲和标记是位于所述第一步单向引导延伸引物5’端的生物素标记。3.根据权利要求1所述的减少扩增偏倚的基因突变检测方法，其特征在于，所述第一通用引物与所述第二通用引物是相同的引物。4.根据权利要求1-3任一项所述的减少扩增偏倚的基因突变检测方法，其特征在于，所述第一步单向引导延伸引物与所述第二步单向引导延伸引物均位于所述待检测位点或待检测区域在所述目标区域DNA的同方向。5.根据权利要求1-3任一项所述的减少扩增偏倚的基因突变检测方法，其特征在于，所述第一步单向引导延伸引物与所述第二步单向引导延伸引物间隔距离是0-110bp，优选间隔距离是55bp。6.根据权利要求1-3任...

【专利技术属性】
技术研发人员：王永利，宋卓，袁梦兮，
申请(专利权)人：人和未来生物科技长沙有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43