本发明专利技术公开了一种检测ALDH2基因突变的探针及其应用和试剂盒，属于基因检测技术领域。其包括SEQ ID NO.1所示的检测探针，以及SEQ ID NO.2‑3所示的捕获探针中的一种或两种。该探针可针对ALDH2基因的rs671位点的G→A突变进行检测，其具有检测灵敏度高、特异性强、假阳性率低等特点。
A probe for detecting ALDH2 gene mutation, its application and kit
The invention discloses a probe for detecting ALDH2 gene mutation, an application and a kit thereof, belonging to the technical field of gene detection. The SEQ ID includes a detection probe shown in the NO.1, SEQ and ID NO.2 3 shows the capture probe in one or two. The probe can detect the mutation of G A in rs671 locus of ALDH2 gene, which has the characteristics of high sensitivity, strong specificity and low false positive rate.
【技术实现步骤摘要】
一种检测ALDH2基因突变的探针及其应用和试剂盒
本专利技术涉及基因检测
，具体而言，涉及一种检测ALDH2基因突变的探针及其应用和试剂盒。
技术介绍
乙醛脱氢酶(AcetaldehydeDehydrogenase，ALDH)由ALDH基因编码，可分为ALDH1A1、ALDH1B1和ALDH2。其中，ALDH2在人体内把乙醛催化成乙酸的能力最强。ALDH2基因位于第12号染色体(12q24)，由13个外显子构成，编码的酶蛋白肽链由500个氨基酸残基组成。研究表明，该基因的多态性在亚洲人群中很常见，并且可能影响人群的饮酒行为。ALDH2与亚洲人群最为密切的是ALDH2基因的rs671位点G→A突变，可导致其编码的多肽链谷氨酸(Glu)变为赖氨酸(Lys)。ALDH2基因与酒精在人体内的分解代谢有关，还参与硝酸甘油的代谢。饮酒后吸收进入体内的乙醇，主要在肝脏进行代谢。乙醇被氧化成乙醛后，95％在肝脏变成乙酸，余下5％在其他组织及血液被代谢掉。乙醇在体内代谢产物是乙醛，是导致酒精性肝病的主要原因。由于ALDH2G(ALDH2*1)的基因序列发生突变形成ALDH2L(ALDH2*2)等位基因，二者随机组合可编码形成ALDH2GG、ALDH2GL或ALDH2LL，3种基因型。ALDH2*1/ALDH2*1基因型(野生型)的饮酒者，体内把乙醛氧化成乙酸能力很强，对乙醇耐受性高，可以过量饮酒，但应适当节制。ALDH2*1/ALDH2*2基因型(突变型杂合型)的饮酒者，血液中乙醛的浓度是前者的6倍，对酒有一定的耐受性，可以适量饮酒。ALDH2*2/ALDH2*2基因型(突变型纯合型)的饮酒者血液中乙醛的浓度是前者的19倍，对酒敏感，没有耐受性，饮酒后很快出现严重不适现象。大量乙醛滞留在体内，除了损伤肝脏导致脂肪肝、肝硬化，甚至肝癌，还与增加食道癌、口咽癌和胃癌、冠心病、心肌梗死等风险相关。硝酸甘油作为抗心绞痛的经典药物，已有多位学者对其生物转化机制进行了广泛研究，2002年Chen等发现在巯基化合物参与下，ALDH2能够催化硝酸甘油生成1，2-二硝酸甘油和亚硝基硫醇，之后ALDH2在硝酸甘油代谢中的重要作用引起越来越多学者的关注。研究发现，ALDH2*1/ALDH2*1基因型(野生型)具有ALDH2的正常活力，ALDH2*1/ALDH2*2基因型(突变型杂合型)存在6％的酶活力，而ALDH2*2/ALDH2*2基因型(突变型纯合型)则完全丧失酶的活力，使硝酸甘油无法产生一氧化氮，难以发挥药效。ALDH2除了与酒精性肝病等消化道疾病息息相关外，还与其他一些疾病相关，如消化道肿瘤、白血病、帕金森病(PD)等。ALDH2位点的多态性为先天遗传，与任何疾病的发生无关，与年龄无关。研究表明，ALDH2*2在人类各族群中的分布是不同的，亚洲人种出现频率较高。中国汉族ALDH2*2的频率为15.5％，墨西哥1.0％，日本人23.8％，欧洲人0％，南非人0％。中国人群中广东汉族最高，达31％，武汉汉族12％，洛阳人15％，上海人25％，台湾人30％。此外，ALDH2各基因型的发生率在男女性别上差异无统计学意义。综上所述，ALDH2基因多态性检测将为硝酸甘油的用药、饮酒指导及相关高风险疾病的提示提供有效的参考依据，具有重要的临床应用意义。目前，用于ALDH2基因分型的方法有以下几种，各有其特点。1.限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术(PCR-RFLP)PCR-RFLP为最为经典的SNP分型方法，它先利用PCR扩增跨越多态位点的靶DNA，然后用相应的限制性核酸内切酶切割PCR产物，最后根据酶切产物的电泳条带判断基因型。例如Hayashida等曾用该法对ALDH2进行分型，PCR扩增目的片段长度为430bp，野生型等位基因(ALDH2*1)会被AcuⅠ酶切成296bp和134bp2个片段，反之，突变型等位基因(ALDH2*2)则不能被AcuⅠ酶切。这样野生型纯合子ALDH2*1/*1的条带为296bp、134bp，杂合子ALDH2*1/*2的条带为430bp、296bp、134bp，突变型纯合子ALDH2*2/*2的条带为430bp。PCR-RFLP分型法操作简单，所需模板DNA量少，无需使用大型贵重仪器，实验中不涉及危险试剂，安全性高。但该法的一个最大缺点在于，会因为内切酶的活性、酶切时间、酶切体系的不恰当等原因造成假阴性或假阳性而出现基因型的误判。2.等位基因特异性PCR(allelespecificPCR，AS-PCR)AS-PCR的基本原理是根据SNP位点的碱基特点设计2条等位基因特异引物(针对于野生型等位基因的P1、针对突变型等位基因的P2)，它们的3’末端与SNP位点的碱基互补(或相同)，另需一条按常规方法设计的公共用引物P3。用P1、P3作引物，在野生型等位基因中有扩增产物，在突变型等位基因中没有扩增产物，用P2、P3作引物，情况则刚好相反。PCR结束后，用凝胶电泳检测扩增产物的有无，从而确定基因型。AS-PCR方法避免采取酶切方法，步骤更简洁，但是等位基因特异性PCR扩增方法的假阳性率较高，其对实验要求较严格。3.Taqman探针技术Taqman探针技术在普通PCR的基础上增加荧光标记的探针，随着PCR产物的不断增加，荧光的强度不断增强，则可以检测到一个荧光增长曲线。该法的主要不足是采用荧光淬灭及双末端标记技术，其定量检测受酶活性的影响；本底较强，有时无法鉴别高度相关序列；探针标记以及实验仪器成本较高，不便普及应用。4.高分辨率熔解曲线法高分辨率熔解曲线分析技术(highresolutionmelting，HRM)是在实时荧光PCR基础上发展起来的一种新技术，它在PCR体系中加入饱和双链DNA结合染料，在PCR结束后制作高分辨率熔解曲线，根据熔解曲线的不同来对样品进行分型。该方法因其快速、通量大、使用成本低、结果准确，并且实现了真正的闭管操作而受到普遍的关注。但HRM技术对仪器温度的均一性要求非常高，需LightCycleryTM480PCR仪或LightScanner等价格高昂的专用仪器及精密的分析软件。另外，该法要求扩增片段的大小在400bp以下，引物设计受到局限，PCR条件的优化比较复杂。5.直接测序法。测序法是检测SNP的金标准，准确度高。包括直接测序(双脱氧链终止法)、焦磷酸测序及微测序等。测序需要一些特殊的仪器设备，需要专业人员操作，费用高，周期长；对PCR产物的量、纯度及特异性要求高，PCR后操作步骤繁琐。测序法目前在临床检测方面的应用还是有一定的困难，多作为其他分析方法的确认。6.变性高效液相色谱法。该方法的原理基于发生错配的杂合双链DNA与完全匹配的纯合双链DNA解链特征的差异，利用色谱方法进行分离。由于杂合双链在突变位点处出现错配，易于形成“Y”型结构，与色谱柱的固定相结合能力降低，因此杂合双链DNA比纯合双链DNA优先洗脱出来，通过洗脱峰的改变可以判断是否存在突变。但它只可判断有无突变，不能确定SNP的位置和类型，需用标准样品或结合测序验证，且需要昂贵特殊仪器及专业分析软件，这也是DHPLC未能得以广泛推行的原因之一。此外，检测过程需要打开反应管，容易造成污染。有鉴于此，特提出本本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测ALDH2基因突变的探针，其特征在于，其包括SEQ ID NO.1所示的检测探针，以及SEQ ID NO.2‑3所示的捕获探针中的一种或两种，所述检测探针的5’端或3’端标记有用于结合催化酶的亲和物。
【技术特征摘要】
1.一种检测ALDH2基因突变的探针，其特征在于，其包括SEQIDNO.1所示的检测探针，以及SEQIDNO.2-3所示的捕获探针中的一种或两种，所述检测探针的5’端或3’端标记有用于结合催化酶的亲和物。2.根据权利要求1所述的检测ALDH2基因突变的探针，其特征在于，所述亲和物为地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的任意一种。3.权利要求1或2所述的检测ALDH2基因突变的探针在制备用于检测ALDH2基因突变的试剂盒中的应用。4.一种试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1或2所述的检测ALDH2基因突变的探针。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于将所述探针的所述捕获探针固定至检测孔板的固定物，所述固定物包括导电聚合物和离子化合物；所述导电聚合物为选自吡咯、苯胺和噻吩中的任意一种；所述离子化合物为选自氯化钠和氯化钾中的任意一种。6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括所述催化酶，所述催化酶是...
【专利技术属性】
技术研发人员：廖玮，莫亚勤，林晓燕，张晨光，
申请(专利权)人：北京易活生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。