一种检测Pygo2基因突变位点的试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种基于ARMS‑qPCR法检测Pygo2基因R46S突变的试剂盒，属于生物技术和医学领域。所述检测试剂盒包括R46S突变检测反应液，反应液包含引物、荧光探针、dNTP及PCR缓冲液，其中引物包含一对外引物和区分突变的内引物。本发明专利技术所提供的Pygo2基因突变ARMS‑qPCR检测试剂盒是基于RT‑PCR技术和ARMS‑PCR技术的检测试剂盒，该试剂盒特异性高、操作快速简便、灵敏度高，同时试剂盒中的一对外引物能够保证反应的高效性和参照性。

Kit for detecting Pygo2 gene mutation site

The invention provides a kit for detecting Pygo2 gene R46S ARMS mutation based on qPCR method, belonging to the field of biotechnology and medicine. The detection kit comprises a R46S mutation detection reaction solution, comprising a primer, a fluorescent probe, a dNTP and a PCR buffer, wherein the primer comprises an external primer and an internal primer for distinguishing mutations. The invention provides a Pygo2 gene mutation of ARMS qPCR kit is a test kit for RT PCR and ARMS technology based on PCR technology, the kit has high specificity, rapid and simple operation, high sensitivity, and a foreign primer kit can ensure the reaction efficiency and reference.

【技术实现步骤摘要】
一种检测Pygo2基因突变位点的试剂盒
本专利技术涉及生物技术和医学领域，具体涉及一种检测Pygo2基因突变位点的试剂盒。
技术介绍
Wnt信号通路广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，是一类在物种进化过程中高度保守的信号通路。Wnt信号在动物胚胎的早期发育、器官形成、组织再生和其它生理过程中，具有至关重要的作用。如果这条信号通路中的关键蛋白发生突变或者异常表达，导致信号异常活化，就可能诱导癌症的发生。Wnt信号通路包括经典的Wnt信号通路与非经典的Wnt信号通路，在经典通路即Wnt-β-catenin信号通路中，Wnt因子通过激活细胞膜上的Frizzle/LRP5/6协同受体后抑制细胞内游离β-catenin蛋白的磷酸化和降解，细胞质中的β-catenin蛋白水平升高后将发生β-catenin蛋白的核移位，导致细胞核中β-catenin蛋白升高，胞核中β-catenin蛋白能够联合Pygo2、Bcl-9以及FoxM1蛋白共同与TCF/LEF-1转录因子家族形成复合体并激活Wnt信号通路下游靶基因的转录激活。Pygo2蛋白是Wnt信号通路中β-catenin下游重要成员之一，目前越来越多的研究已经发现，在很多肿瘤中Pygo2蛋白均呈现高表达。目前研究核心信号通路的核心分子调控机制，以及某些重要成员在细胞中的表达水平，已经成为治疗肿瘤的一种关键手段。近年来Wnt信号通路在癌症中的研究，以及Pygo2蛋白作为Wnt信号通路重要成员其表达水平的研究，已经成为研究开发肿瘤药物急需解决的重要问题。与此同时，其在多种肿瘤细胞中存在的各种基因突变也越来越多地被发现，尤其是在Pygo2蛋白NHD端及PHD端发生的突变，对Pygo2蛋白发挥功能起着非常重要的作用，例如在膀胱癌细胞中检测出NHD端R46S突变。目前普遍应用的基因突变检测方法为限制小片段长度多态性分析法(RFLP法)和DNA直接测序等。RFLP法是将PCR与限制性酶切相结合的方法。但是该方法存在以下缺点：RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，存在第一轮酶切不完全导致的假阳性，非闭管操作，易于污染，难以满足临床检测要求。DNA直接测序的原理是：该方法存在以下缺点检测周期较长，花费昂贵，非闭管操作，难以避免交叉污染，通量不高。DNA直接测序的灵敏度较低，杂合突变、胶压缩、GC富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精确的数据，需要多次重复测序才可能避免假阳性等，因此直接测序方法难适用于临床检测。而临床迫切需要开发一种快速、准确、操作简便和避免交叉污染的检测Pygo2基因突变的试剂盒，满足临床用药和检测诊断方面的时效性要求。Taqman探针是在Real-timePCR技术平台发展出的荧光检测技术，探针的5’端含有荧光报告基团，3’端含有荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，当进行PCR扩增时，TaqDNA聚合酶的5’端到3’端的外切酶活性将探针酶切降解，使得报告基团和淬灭基团分离，发出荧光信号，从而达到荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步。ARMS,(AmplificationRefractoryMutationSystem)，中文全称叫扩增受阻突变系统也叫等位基因特异性扩增法(AlleleSpecificAmplification，ASA)，始建于1989年，是基于PCR技术的一种定向检测点突变的应用方法。ARMS是针对已知突变基因的一种检测方法之一。检测的原理是利用了实验室常用的DNA聚合酶—Taq酶缺乏3’端到5’端外切酶活性的特点，针对突变碱基设计的引物由于错配而导致扩增反应受阻，当这种阻碍效应达到一定程度时，3’端延伸受阻，反应无法继续进行，因此如果模板中不含有突变的目标序列，则扩增产物中检测不到目标条带。Taqman-ARMS该技术基于Real-timePCR平台，结合ARMS突变富集和Taqman特异性荧光检测两种技术。利用ARMS引物对突变靶序列进行PCR扩增，Taqman探针对扩增产物进行特异性位点检测，在Real-timePCR基础上鉴定特定突变。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供快速、准确、操作简便和防止污染的检测Pygo2基因突变位点的试剂盒，解决了现有技术中进行基因突变检测程序繁琐、费用昂贵、费时、易污染和灵敏度低等问题，尤其是提供了病理组织之外的非创伤性如血清或血浆等检测。为实现上述专利技术目的，本专利技术的技术方案为：一种检测Pygo2基因突变位点的试剂盒，所述试剂盒包含检测Pygo2基因R46S突变位点的ARMS引物对和特异识别R46S突变的Taqman探针；所述ARMS引物对由SEQIDNo：1所示的上游引物和SEQIDNo：2所示的下游引物组成；所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNo：3所示，其5’端的荧光报告基团为：FAM，3’端的淬灭基团为BHQ。Pygo2基因R46S突变位点在Pygo2基因的具体位置为密码子46处，其碱基的变化为AGC>AGG，SEQIDNo：1、2被称为内引物对。优选的，所述试剂盒还包括DNA质量控制位点的检测引物对和识别所得扩增子的Taqman探针，所述引物对由SEQIDNo：4所示的上游引物和SEQIDNo：5所示的下游引物组成，所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNo：6所示，其5’端的荧光报告基团为：HEX，3’端的淬灭基团为BHQ。SEQIDNo：4、5被称为外引物对，该外引物对扩增的区域是Pygo2基因中包含R46S突变位点所在区域片段，其序列如SEQIDNo：7所示。更优选的，所述试剂盒由PCR缓冲液、dNTPs、引物对、Taqman探针、MgCl2、TaqDNA聚合酶和模板DNA组成，各组分反应时终浓度为：更优选的，所述试剂盒的反应条件是：42℃逆转录20min；94℃预变性，5min；94℃变性，30s；58℃，30s；进行40个循环。更优选的，利用所述试剂盒完成PCR反应后，如果样本外引物和内引物扩增曲线呈S型，有Ct值，且ΔCt值<7，可判断为突变；如果样本外引物扩增曲线呈S型，内引物扩增曲线平直，可以判为阴性；如果样本外引物扩增曲线平直，内引物欧增呈S型，可以判断为假阳性。更优选的，所述试剂盒还包括两个阳性对照，该阳性对照为包含外引物扩增区域的质粒和Pygo2基因R46S突变位点所在区域片段质粒。更优选的，所述试剂盒还包括阴性对照，该阴性对照为灭菌生理盐水。本专利技术与现有技术相比，具有以下优势：本专利技术公开的试剂盒，采用ARMS特异突变富集技术与Taqman探针特异检测技术相结合，无需测序，即可完成对样品基因型的判断；该试剂盒灵敏度高，最高可达到1％，同时特异性好，精度高，检测成功率为100％，同时可以检测多个样本，实现高通量检测；检测灵敏度高、检测范围宽；无需多次开盖，避免交叉污染，全部检测反应可在1小时内完成，且检测结果容易判断；该试剂盒可以检测来自外周血的DNA；根据试剂盒的检测结果为肿瘤的个性化用药提供指导。附图说明图1是本专利技术Pygo2基因R46S突变ARMS-qPCR试剂盒对野生型人DNA测试的扩增曲线图；图2是本专利技术Pygo2基因R46S突变ARMS-qPCR试剂盒对含1％Pygo2突变的人D本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测Pygo2基因突变位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测Pygo2基因R46S突变位点的ARMS引物对和特异识别R46S突变的Taqman探针；所述ARMS引物对由SEQ ID No：1所示的上游引物和SEQ ID No：2所示的下游引物组成，其中在上游引物3’端倒数第3个位点上引入了第二个错配碱基，SEQ ID No：1、2被称为内引物对；所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示，其5’端的荧光报告基团为：FAM，3’端的淬灭基团为BHQ。

【技术特征摘要】
1.一种检测Pygo2基因突变位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测Pygo2基因R46S突变位点的ARMS引物对和特异识别R46S突变的Taqman探针；所述ARMS引物对由SEQIDNo：1所示的上游引物和SEQIDNo：2所示的下游引物组成，其中在上游引物3’端倒数第3个位点上引入了第二个错配碱基，SEQIDNo：1、2被称为内引物对；所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNo：3所示，其5’端的荧光报告基团为：FAM，3’端的淬灭基团为BHQ。2.根据权利要求1所述检测Pygo2基因突变位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA质量控制位点的检测引物对和识别所得扩增子的Taqman探针，所述引物对由SEQIDNo：4所示的上游引物和SEQIDNo：5所示的下游引物组成，SEQIDNo：4、5被称为外引物对；所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNo：6所示，其5’端的荧光报告基团为：HEX，3’端的淬灭基团为BHQ。3.根据权利要求2所述检测Pygo2基因突变位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由PCR缓冲液、dNTPs...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦文英，唐景峰，周策凡，张毅，李舜尧，何文早，陈兴珍，胡婷，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42