一种检测PIK3CA基因突变的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测PIK3CA基因突变的试剂盒，包括以下序列的肽核酸和特异性引物：(1)针对PIK3CA基因第9外显子的肽核酸和特异性引物：如SEQ ID NO.1～3所示；(2)针对PIK3CA基因第20外显子的肽核酸和特异性引物：如SEQ ID NO.4～6所示。利用上述试剂盒检测PIK3CA基因突变的方法，包括以下步骤：(1)提取待检测样本的DNA；(2)以上述提取的DNA为模板，利用上述检测PIK3CA基因突变的试剂盒进行定量PCR扩增，检测ΔCt值；(3)判断：若ΔCt＞8，则待检测样本的PIK3CA基因的基因型为野生型；若ΔCt＜8，则待检测样本的PIK3CA基因的基因型为突变型，具有操作简便，耗时短，灵敏度高，检测结果准确可靠等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测PIK3CA基因突变的试剂盒。
技术介绍
PIK3CA基因是由Volinia在1994年利用原位杂交技术检测到的，编码I类磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylino-sitol3-kinases，PI3Ks)的p110催化亚单位。第9外显子和第20外显子的突变不仅可以减少细胞的凋亡还可以促进肿瘤的浸润、提高其下游激酶PI3Ks的活性。其突变提高其下游激酶PI3Ks的活性，可以减少细胞的凋亡还可以促进肿瘤的浸润。目前，临床上的检测方法需要先进行基因片段扩增，然后利用测序的方法检测基因突变。该方法成本较高，检测费用昂贵。而且，由于在基因片段扩增过程中，对突变基因和野生基因都进行了同等程度的扩增，因此在测序检测时灵敏度不高，仅有10％左右，且操作比较繁琐，耗时较长。此外，对于血液标本，由于灵敏度低，所以很难从中检测到突变。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了一种检测PIK3CA基因突变的试剂盒，其具有灵敏度高、检测结果准确可靠等优点。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种检测PIK3CA基因突变的试剂盒，包括以下序列的肽核酸和特异性引物：(1)针对PIK3CA基因第9外显子的肽核酸和特异性引物：所述肽核酸的序列为：5’-TCTGAAATCACTGAGCAG-3’；如SEQIDNO.1所示；所述特异性引物的序列为：正向引物：5’-GAGACAATGAATTAAGGGAAAATGA-3’；如SEQIDNO.2所示；反向引物：5’-CTCCATAGAAAATCTTTCTCCTGCT-3’；如SEQIDNO.3所示；(2)针对PIK3CA基因第20外显子的肽核酸和特异性引物：所述肽核酸的序列为：5’-TGATGCACATCATGGTG-3’；如SEQIDNO.4所示；所述特异性引物的序列为：正向引物：5’-TGCATACATTCGAAAGACCCTAG-3’；如SEQIDNO.5所示；反向引物：5’-AATCCATTTTTGTTGTCCAGCCA-3’；如SEQIDNO.6所示；。进一步地，所述试剂盒中还包括PCR反应所必需的反应原料和试剂。所述PCR反应所必需的反应原料和试剂包括：PCR缓冲液，Mg2+和dNTPs的反应混合物，Taq酶，SuperGreen染料，超纯水。一种利用上述试剂盒检测PIK3CA基因突变的方法，包括以下步骤：(1)提取待检测样本(包括各种临床标本，尤其适用于血液标本)的DNA(按照常规的DNA提取试剂盒说明书进行操作即可)；(2)以上述提取的DNA为模板，利用上述检测PIK3CA基因突变的试剂盒进行定量PCR扩增，检测ΔCt值(ΔCt＝Sample+PNA-Sample-PNA)，设立质控对照(质控品必须添加，阳性质控品为经测序证实PIK3CA基因突变阳性的细胞株DNA；阴性质控品为经测序证实PIK3CA基因突变阴性的细胞株DNA)；所述PCR扩增程序为：95℃5分钟；95℃10秒，70℃20秒，58℃20秒，70℃20秒，重复45个循环；(3)判断：若ΔCt＞8，则待检测样本的PIK3CA基因的基因型为野生型；若ΔCt＜8，则待检测样本的PIK3CA基因的基因型为突变型。本专利技术的试剂盒是利用肽核酸(peptidenucleicacids，PNA)的特性设计而成。PNA是一种人工合成的核酸类似物，它可结合单一DNA模板，而不能作为引物诱导DNA的合成。与普通核酸的相比，退火温度高出50％。我们设计的PNA序列与野生型基因完全互补，所以，当PNA与DNA模版有一个碱基不匹配时(模板存在突变)，它们之间的结合力将迅速下降，带有突变的基因得到扩增从而被富集，而野生基因的扩增被抑制。最终，根据ΔCt值来评价检测结果，具体标准为：ΔCt＞8时，标本为野生型；ΔCt＜8时，标本为PIK3CA基因突变型(ΔCt＝Sample+PNA-Sample-PNA)。本专利技术用于检测PIK3CA基因突变的试剂盒及检测方法，操作简便，耗时短，灵敏度高，检测结果准确可靠，具有以下优点：1.该试剂盒成本较低，降低了基因突变的检测费用。2.在检测过程中，通过对野生型的抑制及突变型的扩增，最终达到富集突变型基因片段的目的，大大提升突变检出的灵敏度。3.由于技术灵敏度高，所以对血液样本基因突变检出率很好，为临床上难以得到组织标本的患者提供检测新途径。4.结果呈现简单，操作方便。5.可用于大规模肿瘤高危人群筛查、肿瘤的早期诊断及疗效预后的动态观察。附图说明图1：突变基因占模板总量比率为50％时，加入PNA与不加入PNA的荧光扩增曲线(加入PNA的扩增曲线在前)。图2：突变基因占模板总量比率为25％时，加入PNA与不加入PNA的荧光扩增曲线(加入PNA的扩增曲线在前)。图3：突变基因占模板总量比率为12.5％时，加入PNA与不加入PNA的荧光扩增曲线(加入PNA的扩增曲线在前)。图4：突变基因占模板总量比率为6.25％时，加入PNA与不加入PNA的荧光扩增曲线(加入PNA的扩增曲线在前)。图5：突变基因占模板总量比率为3.1％时，加入PNA与不加入PNA的荧光扩增曲线(加入PNA的扩增曲线在前)。图6：突变基因占模板总量比率为1.5％时，加入PNA与不加入PNA的荧光扩增曲线(加入PNA的扩增曲线在前)。图7：突变基因占模板总量比率为0.75％时，加入PNA与不加入PNA的荧光扩增曲线(加入PNA的扩增曲线在前)。图8：突变基因占模板总量比率为0.38％时，加入PNA与不加入PNA的荧光扩增曲线(加入PNA的扩增曲线在前)。图9：突变基因占模板总量比率为0.19％时，加入PNA与不加入PNA的荧光扩增曲线(加入PNA的扩增曲线在前)。图10：突变基因占模板总量比率为0％时，加入PNA与不加入PNA的荧光扩增曲线(加入PNA的扩增曲线在前)。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明。下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。实施例1一种检测PIK3CA基因突变的试剂盒利用上述试剂盒进行检测，步骤如下：(1)培养PIK3CA基因阳性的细胞系(第9外显子c.1633G＞A；p.E545K突变细胞系：DLD-1；第20外显子c.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测PIK3CA基因突变的试剂盒，其特征在于：包括以下序列的肽核酸和特异性引物：(1)针对PIK3CA基因第9外显子的肽核酸和特异性引物：所述肽核酸的序列为：5’‑TCTGAAATCACTGAGCAG‑3’；所述特异性引物的序列为：正向引物：5’‑GAGACAATGAATTAAGGGAAAATGA‑3’；反向引物：5’‑CTCCATAGAAAATCTTTCTCCTGCT‑3’；(2)针对PIK3CA基因第20外显子的肽核酸和特异性引物：所述肽核酸的序列为：5’‑TGATGCACATCATGGTG‑3’；所述特异性引物的序列为：正向引物：5’‑TGCATACATTCGAAAGACCCTAG‑3’；反向引物：5’‑AATCCATTTTTGTTGTCCAGCCA‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种检测PIK3CA基因突变的试剂盒，其特征在于：包括以下序列的肽核酸和特异性
引物：
(1)针对PIK3CA基因第9外显子的肽核酸和特异性引物：
所述肽核酸的序列为：5’-TCTGAAATCACTGAGCAG-3’；
所述特异性引物的序列为：
正向引物：5’-GAGACAATGAATTAAGGGAAAATGA-3’；
反向引物：5’-CTCCATAGAAAATCTTTCTCCTGCT-3’；
(2)针对PIK3CA基因第20外显子的肽核酸和特异性引物：
所述肽核酸的序列为：5’-TGATGCACATCATGGTG-3’；
所述特异性引物的序列为：
正向引物：5’-TGCATACATTCGAAAGACCCTAG-3’；
反向引物：5’-AATCCATTTTTGTTGTCCAGCCA-3’。
2.根据权利要求1所述的检测PIK3CA基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还
包括PCR反应所必需的...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋现让，曾倩，
申请(专利权)人：宋现让，
类型：发明
国别省市：山东;37