本发明专利技术涉及一种microRNA‑499的快速检测方法，属于生物检测技术领域，该microRNA‑499的快速检测方法根据待测靶标microRNA‑499的序列设计出与其完全互补的单链DNA序列，而后在单链DNA序列两端分别修饰荧光基团和荧光淬灭基团，从而获得与待测靶标microRNA‑499相对应的Taqman探针，而后将患者血清、RNase‑free水、DSN酶、Taqman探针和RNA酶抑制剂按照一定的比例在特定的条件下进行反应，在激光的激发作用下，检测出反应液的荧光强度，即得到待测靶标microRNA‑499的检测结果，该检测方法大大缩短了心肌损伤标志物microRNA‑499的检测时间，在保证检测质量的基础上，提高了检测效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测领域，尤其涉及一种microRNA-499的快速检测方法。
技术介绍
急性心肌梗死是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死。临床上多有剧烈而持久的胸骨后疼痛，休息及硝酸酯类药物不能完全缓解，伴有血清心肌酶活性增高及进行性心电图变化，可并发心律失常、休克或心力衰竭，常可危及生命。该病在欧美最为常见，美国每年约有150万人发生心肌梗死。中国近年来呈明显上升趋势，每年新发至少50万，现患至少200万。由此可见，急性心肌梗死的早期检测是尤为重要的，在现有的研究中，急性心肌梗死的早期检测包括对microRNA-499的检测、microRNA-208b的检测、microRNA-1的检测以及microRNA-133a的检测。现有技术中，对上述四个心肌损伤标志物的检测通常需要采用1小时的microRNA的抽提、1.5小时的逆转录以及1.5小时的Real-timePCR(荧光定量聚合酶链反应)，一个心肌损伤标志物的检测时间至少要4个小时，从检测开始到得到检测结果的时间很长，众所周知的，对人体疾病的检测，时间的长短尤为重要；另外，现有技术中，对上述的四个心肌损伤标志物的检测步骤也较为繁琐，工作量非常大；漫长的检测过程不仅仅会让病人等待的更为烦躁，也让检测的医护人员感到身心俱疲。
技术实现思路
针对上述存在的问题，本专利技术提供一种microRNA-499的快速检测方法，应用于急性心肌梗死的心肌损伤标志物的检测中，以克服采用现有技术中的检测方法检测microRNA-499这个心肌损伤标志物导致检测时间很长、工作量较大的问题，从而大大缩短了microRNA-499这个心肌损伤标志物的检测时间，并且简化了上述microRNA-499这个心肌损伤标志物的检测方法，在保证检测质量的基础上，提高了检测效率。为了实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种microRNA-499的快速检测方法，其中，包括：备料：准备好患者血清、RNase-free水、浓度为18uM/uL的RNA酶抑制剂以及浓度为0.18uM/uL的DSN酶；设计探针：根据待测靶标microRNA-499的序列设计出与其完全互补的单链DNA序列，而后在所述单链DNA序列两端分别修饰荧光基团和荧光淬灭基团，获得浓度为200nmol/uL的Taqman探针；反应：将所述患者血清、所述RNase-free水、所述DSN酶、所述Taqman探针和所述RNA酶抑制剂按照100:278:2:20:1的配比进行混合，在85℃的反应温度下反应25分钟；检测：根据相应Taqman探针设置反应所需的激发波长和发射波长，使用全自动酶标仪检测反应步骤中的反应液的荧光强度，即得到所述患者血清中的microRNA-499的检测结果；其中，与所述microRNA-499完全互补的单链DNA序列为：TTAAACATCACTGCAAGTCTTAA。上述的microRNA-499的快速检测方法，其中，所述患者血清的收集包括：获取患者的静脉血5mL，以3000rpm离心10min，分离血清用于检测。上述的microRNA-499的快速检测方法，其中，所述荧光基团为：5'-Cy3。上述的microRNA-499的快速检测方法，其中，所述荧光淬灭基团：BHQ2-3'。上述的microRNA-499的快速检测方法，其中，所述Taqman探针为：5'-Cy3-TTAAACATCACTGCAAGTCTTAA–BHQ2-3'；其中，Cy3染料的激发波长为550nM，发射波长为570nM，且检测步骤中的激发波长和发射波长与所述Cy3染料的激发波长和发射波长相同。上述技术方案具有如下优点或者有益效果：本专利技术提供的microRNA-499的快速检测方法，根据待测靶标microRNA-499的序列设计出与其完全互补的单链DNA序列，而后在单链DNA序列两端分别修饰荧光基团和荧光淬灭基团，从而获得与待测靶标microRNA-499相对应的Taqman探针，而后将患者血清、RNase-free水、DSN酶、Taqman探针和RNA酶抑制剂按照一定的比例在特定的条件下进行反应，在激光的激发作用下，检测出反应液的荧光强度，即得到待测靶标microRNA-499的检测结果，该检测方法极为简单，且用时较少，从而克服了采用现有技术中的检测方法检测microRNA-499这个心肌损伤标志物导致检测时间很长、工作量较大的问题，大大缩短了上述microRNA-499这个心肌损伤标志物的检测时间，在保证检测质量的基础上，提高了检测效率。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术及其特征、外形和优点将会变得更加明显。在全部附图中相同的标记指示相同的部分。并未刻意按照比例绘制附图，重点在于示出本专利技术的主旨。图1是本专利技术实施例1提供的microRNA-499的快速检测方法中不同浓度的microRNA-499标准品荧光强度的变化示意图；图2是本专利技术实施例1提供的microRNA-499的快速检测方法中microRNA-499标准品浓度与荧光强度的相关性示意图；具体实施方式下面结合具体的实施例对本专利技术作进一步的说明，但是不作为本专利技术的限定。实施例1：本专利技术实施例1提供的microRNA-499的快速检测方法包括：备料：准备好患者血清、RNase-free水、浓度为18uM/uL的RNA酶抑制剂以及浓度为0.18uM/uL的DSN酶；设计探针：根据待测靶标microRNA——microRNA-499的序列设计出与其完全互补的单链DNA序列(TTAAACATCACTGCAAGTCTTAA)，而后在单链DNA序列两端分别修饰荧光基团(5'-Cy3)和荧光淬灭基团(BHQ2-3')，获得浓度为200nmol/ul的Taqman探针——ProbemicroRNA-499：5'-Cy3-TTAAACATCACTGCAAGTCTTAA-BHQ2-3'；反应：将50ul的患者血清、139ul的RNase-free水、1ul的DSN酶、10ul的Taqman探针ProbemicroRNA-499和0.5ul的RNA酶抑制剂进行混合配置成反应体积，在85℃的反应温度下反应25分钟；检测：由于Taqman探针ProbemicroRNA-499中的Cy3染料的激发波长为550nM、发射波长为570nM，故设置反应所需的激发波长为550nM、发射波长570nM，使用全自动酶标仪检测反应步骤中的反应液的荧光强度，即得到患者血清中的microRNA-499的检测结果。在本专利技术实施例1提供的的microRNA-499的快速检测方法中，患者血清的收集包括：获取患者的静脉血5mL，将静脉血放置于4℃冰箱中静置30min，以3000rpm离心10min，而后收集上清液于无菌RNA-free的EP管中，存储于-80℃的冰箱中备用，用于检测。图1是本专利技术实施例1提供的microRNA-499的快速检测方法中不同浓度的microRNA-499标准品荧光强度的变化示意图；由图可知，发射波长在570nM左右时，不同浓度的microRNA-499标准品荧光强度均处于峰值，因此，在发射波长为570nM时，可以很好的检测到反应液中的荧光强度。图本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种microRNA‑499的快速检测方法，其特征在于，包括：备料：准备好患者血清、RNase‑free水、浓度为18uM/uL的RNA酶抑制剂以及浓度为0.18uM/uL的DSN酶；设计探针：根据待测靶标microRNA‑499的序列设计出与其完全互补的单链DNA序列，而后在所述单链DNA序列两端分别修饰荧光基团和荧光淬灭基团，获得浓度为200nmol/uL的Taqman探针；反应：将所述患者血清、所述RNase‑free水、所述DSN酶、所述Taqman探针和所述RNA酶抑制剂按照100:278:2:20:1的配比进行混合，在85℃的反应温度下反应25分钟；检测：根据相应Taqman探针设置反应所需的激发波长和发射波长，使用全自动酶标仪检测反应步骤中的反应液的荧光强度，即得到所述患者血清中的microRNA‑499的检测结果；其中，与所述microRNA‑499完全互补的单链DNA序列为：TTAAAC ATC ACT GCAAGT CTT AA。
【技术特征摘要】
1.一种microRNA-499的快速检测方法，其特征在于，包括：备料：准备好患者血清、RNase-free水、浓度为18uM/uL的RNA酶抑制剂以及浓度为0.18uM/uL的DSN酶；设计探针：根据待测靶标microRNA-499的序列设计出与其完全互补的单链DNA序列，而后在所述单链DNA序列两端分别修饰荧光基团和荧光淬灭基团，获得浓度为200nmol/uL的Taqman探针；反应：将所述患者血清、所述RNase-free水、所述DSN酶、所述Taqman探针和所述RNA酶抑制剂按照100:278:2:20:1的配比进行混合，在85℃的反应温度下反应25分钟；检测：根据相应Taqman探针设置反应所需的激发波长和发射波长，使用全自动酶标仪检测反应步骤中的反应液的荧光强度，即得到所述患者血清中的microRNA-499的检测结果；其中，与所述microRNA...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩志君，高明珠，黄红宇，
申请(专利权)人：无锡市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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